3.3.1. Dấu hiệu bệnh lý
Sau khoảng 15h – 20h cảm nhiễm chúng tôi bắt đầu thấy trên những chỗ làm bị thương xuất hiện những sợi nấm mảnh mọc lên, sau khoảng 24h bắt đầu thấy nấm phát triển lên thành từng búi nấm trắng như bông, một đầu sợi nấm
bám vào da của cá, đầu kia tự do ngoài môi trường nước. Cá bị bệnh có hiện tượng bơi lội hỗn loạn, không bình thường, bơi sát nhau cọ xát lẫn nhau và cọ xát vào thành bể, sục khí làm tróc vẩy trầy da tạo cơ hội thuận lợi cho vi khuẩn và kí sinh trùng gây bệnh xâm nhập làm cá bị bệnh nặng hơn và tác hại sẽ nghiêm trọng thêm.
Những dấu hiệu bệnh tính ở cá chép thu được sau khi cảm nhiễm giống với dấu hiệu bệnh lý của cá bị bệnh nấm thuỷ mi tại các tỉnh phía Bắc [5].
3.3.2. Kết quả phân lập
3.3.2.1. Đặc điểm hình thái
3.3.2.1.1. Khuẩn lạc
- Tốc độ sinh trưởng khuẩn lạc: Khuẩn lạc sinh trưởng nhanh trên môi trường GY agar ở 200C, tốc độ phát triển trung bình là 3cm/ngày. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 200C đường kính khuẩn lạc đạt 8,95 cm.
- Đặc điểm khuẩn lạc: Khuẩn lạc có màu hơi trắng, sợi nấm phát triển dày đặc, nổi trên bề mặt môi trường có màu trắng bông, khuẩn lạc phát triển tròn đều.
Hình 3.7. Khuẩn lạc nấm sau 2 ngày.
3.3.2.1.2. Sợi nấm
Sợi nấm lúc đầu có màu trắng, kích thước nhỏ, chưa phân nhánh. Sau 2h nuôi cấy trong môi trường nước ao khử trùng sợi nấm bắt đầu phân nhánh. Sau đó từ đầu sợi nấm bắt đầu hình thành vách ngăn chuẩn bị tập trung nhiều nguyên sinh chất để trở thành túi bào tử.
Hình 3.8. Đầu sợi nấm bình thường Hình 3.9. Sợi nấm bắt đầu phân nhánh
Hình 3.10. Sợi nấm bắt đầu phình to Hình 3.11. Chuẩn bị xuất hiện vách ngăn
Hình 3.12. Sợi nấm phân chia vách ngăn rõ
3.3.2.1.3. Phương thức sinh sản bào tử
- Sau 2- 12h nuôi cấy trong nước ao khử trùng, nguyên sinh chất tập trung dày
đặc ở phần đỉnh đầu, đỉnh đầu phồng lớn, sinh ra vách ngăn. Nguyên sinh chất phân cắt hình thành bào tử.(hình 3.13)
3.3.2.1.4. Túi bào tử
Khi dinh dưỡng đầy đủ nấm sinh trưởng tương đối nhanh, đỉnh đầu sợi nấm phồng lớn, hút chất dinh dưỡng từ phần gốc. Sau khi hết chất dinh dưỡng nguyên sinh chất hình thành tập trung nhiều ở phần đỉnh đầu sợi nấm và đây gọi là túi bào tử.
3.3.2.1.5. Sự hình thành bào tử
- Bào tử được hình thành bên trong túi bào (Sporangium), ban đầu là sự hình thành các bào tử hình cầu dày đặc, không vận động phân bố trong túi bào tử. (Hình 3.15)
- Trước khi giải phóng, các bào tử trong túi bào tử trở thành động bào tử, có số lượng lớn vận động không định hướng trong túi bào tử. (Hình 3.16)
3.3.2.1.6. Quá trình giải phóng bào tử
Quá trình giải phóng bào tử diễn ra sau 12- 24h nuôi cấy trong môi trường nước ao khử trùng. Sau 1-2h vận động hỗn loạn trong túi bào tử, sau đó bào tử phá một lỗ nhỏ ở phần đỉnh túi bào tử, bào tử được giải phóng ra.
Hình 3.14. Túi bào tử chứa nguyên Hình 3.15. Túi bào tử chứa các bào sinh chất.(x100) tử hình cầu không vận động.(x100)
Hình 3.16. Các bào tử phân chia Hình 3.17.Các bào tử chuẩn bị được rõ rệt, chuyển động trong túi bào tử. giải phóng ra khỏi túi bào tử
3.3.2.2. Đặc điểm của nấm
3.3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của khuẩn lạc nấm
Bảng 3.6. Kết quả phân tích anova của yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng tới sự phát triển của khuẩn lạc nấm
Nhiệt độ (0C) Đường kính khuẩn lạc nấm (cm) LSD0.05 5 0.0 ± 0.0 c 10 3.2 ± 0.1 b 15 8.7 ± 0.26 a 20 9 ± 0.18 a 25 8.5 ± 0.1 a 30 7.6 ± 0.2 d 35 4.3 ± 0.1 e 40 2.1 ± 0.1 f
Hình 3.20. Tốc độ sinh trưởng của nấm ở các nhiệt độ khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường GY agar
Qua kết quả phân tích Anova và bảng so sánh LSD0,05 cho thấy có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 về sự phát triển của khuẩn lạc nấm ở các nhiệt độ khác nhau. Khuẩn lạc nấm phát triển tối ưu ở khoảng 150C –
250C, phát triển tốt nhất ở 200C, trung bình 24h ở 200C đường kính khuẩn lạc phát triển được 3cm và khuẩn lạc nấm phát triển kém ở nhiệt độ100C, 350C, 400C còn ở 50C khuẩn lạc nấm hoàn toàn không phát triển.
3.3.2.2.2. Ảnh hưởng của độ muối đến sự sinh trưởng của khuẩn lạc nấm
* Ảnh hưởng của các nồng độ muối NaCl
Bảng 3.7. Kết quả phân tích anova của các nồng độ NaCl ảnh hưởng đến sự phát triển của khuẩn lạc nấm Saprolegnia
Nồng độ
NaCl (%) Đường kính khuẩn lạc (cm) LSD0.05
4 0 ± 0 a 3 0 ± 0 a 2 3.1 ± 0.256 b 1.5 5.2 ± 0.529 c 1 7.7 ± 0.436 d 0.5 9 ± 0.05e
Hình 3.21. Tốc độ sinh trưởng của nấm sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường GY agar chứa các nồng độ NaCl khác nhau.
Qua kết quả phân tích Anova và bảng so sánh LSD0,05 cho thấy có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 về sự phát triển của khuẩn lạc nấm ở các nồng độ muối NaCl khác nhau. Khuẩn lạc nấm phát triển tốt nhất trên môi trường GY agar cũng như GY agar chứa 0,5% NaCl, càng tăng nồng độ NaCl thì khuẩn lạc càng kém phát triển. Ở NaCl > 3% thì khuẩn lạc nấm hoàn toàn không phát triển.
* Ảnh hưởng của các nồng độ muối KCl
Bảng 3.8. Kết quả phân tích anova của yếu tố muối KCl ảnh hưởng tới sự phát triển của khuẩn lạc nấm Saprolegnia
Nồng độ KCl (%) Đường kính khuẩn lạc nấm (cm) LSD0.05 4.5 0 ± 0 f 0.284 4 2.1 ± 0.1 e 3 5.3 ± 0.05 d 2 6.1 ± 0.1 c 1.5 7.2 ± 0.1 b 1 8.9 ± 0.1a 0.5 8.9 ± 0.1a
Hình 3.22. Tốc độ sinh truởng của khuẩn lạc nấm sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường GY agar chứa các nồng độ muối KCl khác nhau.
Qua kết quả phân tích Anova và bảng so sánh LSD0,05 cho thấy ở nồng độ muối KCl khác nhau thì có sự khác nhau về sự phát triển của khuẩn lạc với mức ý nghĩa thống kê P < 0,05. Khuẩn lạc nấm phát triển tốt trên môi trường GY agar có bổ sung thêm 0,5%; 1% KCl, phát triển kém trên môi trường GY agar có bổ sung thêm 1,5% - 4% KCl và không phát triển khi bổ sung thêm 4,5%KCl.
Từ những kết quả đã phân lập trên chúng tôi kết luận rằng tác nhân gây bệnh là giống nấm saprolegnia.
Theo Lê Văn Khoa (2006). Đây là một loài nấm gây bệnh phổ biến trong môi trường nước ngọt, gây bệnh nấm thuỷ mi ở cá nước ngọt, bệnh rất dễ lây lan, khó phát hiện gây thiệt hại lớn cho người nuôi [6].
Rechenbach - Klinke (1966) nấm bậc thấp thường hay gây ra các bệnh trên cá nước ngọt. Tuy nhiên chỉ là những cá đã bị suy nhược hoặc tổn thương mới mắc bệnh vì trên da cá khỏe mạnh thì các bào tử không thể nảy mầm được. Trong số các tác nhân gây bệnh thì Saprolegnia và Achlya là phổ biến nhất [35].
3.4. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM NƯỚC ÉP LÁ HẸ (Allium tuberosum) DIỆT NẤM SAPROLEGNIA TRÊN CÁ CHÉP
Từ kết quả cảm nhiễm nấm chúng tôi tiến hành thí nghiệm diệt nấm bằng nước ép lá hẹ kết quả được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.10. Tỷ lệ sống của cá chép sau khi điều trị bằng nước ép lá hẹ
Nồng độ Tỷ lệ sống của cá chép thí nghiệm Bể 1 (1,8 x 105) Bể 2 (1,8 x 104) Bể 3 (1,8 x 103) Bể đối chứng 14. 000ppm 90% 100% 100% 10%
Bể 1 sau 1 ngày cảm nhiễm, bể 2 và bể 3 sau 3 ngày cảm nhiễm thì chúng tôi tiến hành ngâm nước ép lá hẹ ở nồng độ 14.000ppm trong 30 phút. Kết quả của 3 bể như sau:
- Bể 1: Sau 2 ngày theo dõi thấy có 1 con bị chết, do cá bị nhiễm nặng quá không thể điều trị được, 9 con còn lại thấy không còn dấu hiệu của nấm nữa, cá bơi lội và ăn bình thường.
- Bể 2 và 3: Sau 2 ngày điều trị thấy toàn bộ cá đều không có dấu hiệu của bệnh, cá bơi lội và ăn bình thường.
- Bể đối chứng: Cá bị nhiễm nấm nhưng không điều trị bằng nước ép lá hẹ. Sau 2 ngày toàn bộ cá bị chết.
Sau 7 ngày theo dõi không có hiện tượng cá có bệnh trở lại và không có con nào chết.Chúng tôi tiến hành lấy vây, vảy cấy trên môi trường GY agar nhưng hoàn toàn không có dấu hiệu của nấm.
Như vậy chứng tỏ nước ép lá hẹ có tác dụng điều trị bệnh do nấm
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Nước ép lá hẹ có khả năng kháng nấm Saprolegnia. sp gây bệnh nấm thuỷ mi trên cá chép.
2. Nồng độ nước ép lá hẹ tối thiểu ức chế nấm Saprolegnia. sp là 12.000ppm. 3. Nồng độ nước ép lá hẹ tối thiểu diệt nấm Saprolegnia. sp là 14.000ppm. 4. Trên đối tượng cá chép nhiễm nấm Saprolegnia sp sử dụng nước ép lá hẹ thì nấm bị tiêu diệt và không tái nhiễm trở lại sau thời gian 7 ngày.
5. Kết quả diệt nấm Saprolegnia sp của nước ép lá hẹ ở cá chép cho tỷ lệ sống từ 90% - 100% so với cá chép không tắm qua nước ép lá hẹ là 10%.
Kiến nghị
1. Nên sử dụng nước ép lá hẹ trong việc điều trị bệnh do nấm Saprolegnia.sp gây ra trên cá chép.
2. Cần có những nghiên cứu tìm ra phương thức chiết xuất lá hẹ để chế phẩm có khả năng diệt được nấm Saprolegnia sp ở nồng độ thấp.
3. Cần tiếp tục thử nghiệm nước ép lá hẹ để điều trị bệnh nấm thuỷ mi trên cá chép cũng như các đối tượng khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu tham khảo tiếng việt
1. Tạ Thị Bình (2006), Bài giảng kỹ thuật nuôi cá nước ngọt, Khoa Nông Lâm Ngư - Đại Học Vinh.
2. Lê văn Dân (2001), Bài giảng kỹ thuật sản xuất cá nước ngọt, Trường Đại học Nông Lâm Huế.
3. Dự án phát triển và trình diễn nuôi hải sản khu vực (RAS/ 90/ 002) Bangkok, Thailan (1991), Hội chứng dịch bệnh lở loét ở cá, NXB Nông Nghiệp.
4. Trần Vĩ Hích (2007), Bài giảng một số đặc điểm của nấm gây bệnh động vật
thuỷ sản, Trường Đại học Nha Trang.
5. Đỗ Thị Hoà, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004),
Bệnh của động vật thuỷ sản, NXB Nông Nghiêp.
6. Lê Văn Khoa (2006),”Bệnh nấm trên cá nước ngọt”, Báo cáo tóm tắt Hội
thảo về quản lý sức khoẻ động vật thuỷ sản Miền Bắc, Viện nghiên cứu
NTTS I.
7. Hà Ký và ctv (1995), Nghiên cứu biện pháp phòng trị bệnh tôm cá, Báo cáo khoa học đề tài cấp nhà nước, mã số KN – 40 – 12, năm 1991 – 1995. Bộ Thuỷ sản, NXB NN, 1996.
8. Đỗ Tất Lợi (1986), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
9. Đỗ Tất Lợi (2003), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học năm 2003, 1274 trang.
10. Nguyễn Ngọc phước, Phạm Thị Phương Lan, Nguyễn Quang Linh, Kishio Hatai (2007), Nghiên cứu khả năng kháng nấm của dịch chiết lá trầu (Piper
11. Bùi Quang Tề (2000), “Kết quả thí nghiệm thuốc phòng bệnh cho cá trắm cỏ nuôi lồng và nuôi ao”, Tuyển tập báo cáo khoa học năm 2000- NXBNN. 12. Bùi Quang Tề, Vũ Thị Tám (2000), Những bệnh thường gặp của tôm cá
nuôi ở đồng bằng Sông Cửu Long và biện pháp phòng trị.
13. Bùi Quang Tề (2002), Bệnh của cá trắm cỏ và biện pháp phòng trị, NXBNN, Hà Nội.
14.Nguyễn Thị Vân Thái, Nguyễn Minh Phúc, Ngô Thị Kim, Nguyễn Kim độ, Lưu Thị Dung (2003), “Bàn về tiềm năng phòng và chữa trị bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh thảo mộc trong NTTS”, Tuyển tập báo cáo khoa học
về NTTS tại Hội Nghị khoa học Toàn quốc lần thứ 2 ( 24 – 25/11/2003),
NXBNN.
15. Nguyễn Thị Vân Thái (2004), Nghiên cứu xây dựng bài thuốc Y học cổ
truyền ứng dụng trong phòng và chữa bệnh cho tôm, cá, Tuyển tập hội thảo
toàn quốc về nghiên cứu và ứng dụng Khoa học công nghệ trong nuôi trồng Thuỷ sản, 2005 ( 22- 23/12- 2004 tại Vũng Tàu), NXBNN.
16. Nguyễn Thị Vân Thái, Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành, Lê Thị Dịu, Vũ văn Vụ (2004), “Nghiên cứu tính kháng khuẩn của nhóm Flavonoids được tách chiết từ Sambucus Chinensis L. Caprifoliaceae”, Tuyển tập hội thảo Toàn
quốc về nghiên cứu và ứng dụng khoa học công nghệ trong nuôi trồng Thuỷ sản, 2005 ( 22- 23/12 – 2004 tại Vũng Tàu ), NXBNN.
17. Nguyễn Thị Thanh Thuỷ, Viện Hải Dương học Nha Trang (2004), “Hiệu quả của chiết cây Cattharanthus roseus L. qua thức ăn đến một số hoạt động miễn dịch không xác định và sức kháng khuẩn Edwardsiella tarda ở cá Chép Rohu giống ( Labeo rohita Hiom)”, Tuyển tập hội thảo Toàn quốc về nghiên
cứu và ứng dụng khoa học công nghệ trong nuôi trồng Thuỷ sản, 2005 ( 22- 23/12 – 2004 tại Vũng Tàu ), NXBNN.
18. Trung tâm nghiên cứu NTTS III, Nha Trang (1991), Bài giảng về bệnh cá tôm.
II. Tài liệu tham khảo tiếng nước ngoài
19. Chuntao Yuan, Dongmei Li, Wei Chen, Fangfang Sun, Guanghong Wu, Yi Gong, janqing Tang, Meifang Shen vaf Xiaodong Han (2007),
Immunological and biochemical prameters in carp(Cyprinus carpio) at Qompsell feed ingridents for long- term adminitration. Aquaculture Research
38(3), 246-255.
20. Kazuyo Nakamura, Kei Yuasa, Somreuk Sinmuk, Kishio Hatai and Naruo Hara (1995), The ubiquinone system in Oomycetes.
21. Kazuyo Nakamura, Miho Nakamura, Kishio Hatai and Zafran (1995),
Lagenidium infection in eggs and larvae of mangrove crab (Scylla serrata) produced in Indonesia.
22. Kishio Haita (1992), Fungal from fish and other aquatic animal, CABI Publishing
23. Kishio Hatai, Gen- Ichi Hoshiai (1993), Characteristics of Two Saprolegnia
species isolated from Coho salmon with Saprolegniosis.
24. Kobori, K., adn Tanabe, T. (1993), Atimicrobial activity of Hinokitiol for
methicillin resistant staphylococus aureus, 1639 – 1642.
25. Le van khoa, Nguyen Thi Ha, Shinpei Wada, Kunika Walita, Kishio Hatai and Kazuo ogawa (2001), Saprolegniasis found medaka in a pound at
Tokyo.
26. LG. Wiloughby DSC (1969) , Fungi and Fish Diseases.
27. Masoomeh Shams- Ghahfarokhi, Mohammad- Reza Shokoohamiri, Nasrin Amirrajab (2006), In vitro antifungal activities of Allium cepa, Allium
sativum, Allium tuberosum and ketoconazole against some pathogenic yeasts and dermatophytes.
28. Mei- Chin Yin , Shih- Tsao (1999), Inhibitory effect of seven Allium plant
upon three Aspergillus.
29. Mortada M.A.Hussein and Kishio Hatai (1999), Saprolegnia salmonis sp.
Nov. isolated from sockeye salmon, Onchrhynchus nerka
30. Mortada M.A.Hussein, Kishio Hatai dan Tetsuichi Nomura (2001),
Saproleniosis in Salmoids and their eggs in Japan.
31. Neish and Hughes (1980), Some biochemical characteristic of the genera
Saprolegnia, Achlya and Aphanomyces isolated from fiches with fungal infection.
32. Nilubol Kitancharoen, Atsushi Ono, Atsushi Yamamoto and Kishio Hatai (1997), The Fungistatic Effect of NaCl on Rainbow trout Saprolegniasis.
33. Nilubol Kitancharoen, Atsushi Yamalmoto and Kishio Hatai (1997),
Fungicidal effect of hydrogen peroxide on fungal in fection of rainbow trout eggs.
34. R.J.Roberts, Rwootten (1999), Fish Diseases.
35. Rechenback- klinke (1966), Some biochemmical characteristic of the genera
Saprolegnia, Achlya and Aphanomyces isolate from fishes with fungal infection.
36. Robell, Yuasa, Kitancharoen (1996), Effect of pH and temperature on
growth of Saprolegnia diclina and S. parasitica isolated from fishes with fungal infection.
37. Sivaram.V, M.M.Bbu, G.Immanuel, S.Murugadass, T.Citarasu and M.P.Marian (2004), Growth and immune response of junevile greasy
groupers (Epinephelustauvina) fed with herbal antibacterial active princile supplemented diets against vibrio harveyi infections.
38. Suruki (1960), Relational of the genera Saprolegnia, Achlya and
39. The aquatic animal heath research institute Department of Fisheries- Bangkok (1995), Fish parasite and Diseases.
40. Vasudeva Rao.Y, M.Romesh, A.Singh and Chakarabarti (2004),
Potentiation of antibody production in Indian major carp Labeo rohita, rohu, by Achiranthes aspera as a herbal feed ingredient.
III. Tài liệu từ Internet
41. Đoàn Giang (2008), Nghiên cứu khả năng kháng nấm của dịch chiết lá trầu,
http://thvm.vn/news.
42. Dùng thảo mộc chữa bệnh cho tôm cá, http://nhanong.net, Sea107- 27/11/2007, NNVN (2007)
43. Hẹ, Bách khoa toàn thư, http://vi.wikipedia.org.
44. Hẹ, Y học cổ truyền, http:// www.Iric-hueuni.edu.vn.
45. Huỳnh Bích Thảo(2004), Trị bệnh cá bằng thuốc nam, http://Agriviet.com.