2.4.1. Phương pháp tách chiết hẹ ( Allium tuberosum)
Hẹ được mua loại tươi, rửa sạch để khô tự nhiên. Dùng 100g hẹ, cắt nhỏ Tên đề tài
Mục tiêu của đề tài
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt tối thiểu của nước ép lá hẹ đối với nấm Saprolegnia.
Cảm nhiễm cá chép với nấm Saprolegnia bể 1
111 bể 2 bể 3 bể 4
Phân lập cá bị nhiễm nấm Kết luận tác nhân gây bệnh
Điều trị cá cảm nhiễm Kết luận và kiến nghị
khoảng 1cm và cho vào máy xay sinh tố xay thật nhuyễn. Dùng lưới lọc có kích thước nhỏ lọc lấy nước nguyên chất của hẹ, loại bỏ phần bã. Nước hẹ đã lọc được lấy làm thí nghiệm và có thể được bảo quản ở tủ lạnh.
2.4.2. Phương pháp thử nghiệm nước ép lá hẹ diệt nấm Saprolegnia trong phòng thí nghiệm phòng thí nghiệm
Quá trình thí nghiệm xác định nồng độ của nước ép lá hẹ diệt nấm Saprolegnia được thể hiện ở sơ đồ sau:
Thí nghiệm 1: Thí nghiệm sàng lọc các nồng độ chế phẩm
Thí nghiệm được bố trí ở các đĩa peptri đã được khử trùng.
Bước 1: Dung dịch nước ép lá hẹ được pha loãng bằng nước cất khử trùng ở
các nồng độ khác nhau, nồng độ sau giảm dần (với nồng độ cao nhất là 100%) và mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Nghiệm thức đối chứng không bổ sung nước ép lá hẹ vào.
Bước 2: Nấm thuần Saprolegnia được nuôi cấy ở môi trường tăng sinh GY
broth. Sau 24h dùng kéo, panh cắt nhỏ những sợi nấm, rửa sạch trong nước cất đã khử trùng 3 lần. Những sợi nấm này cho vào dung dịch nước hẹ ở những
TN1
Xác định được nồng độ thấp nhất của nước ép lá hẹ có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Saprolegnia.
Kết quả ở TN1 được pha loãng và xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của nước ép lá hẹ lên sự phát triển của nấm Saprolegnia.
TN2
TN3
Xác định nồng độ diệt tối thiểu: Những nồng độ nước ép lá hẹ ở TN2 được để trong tủ ấm. Sau 7 ngày nồng độ thấp nhất mà nấm không thể phát triển được.
nồng độ khác nhau đã được pha ở trên tương ứng với thời gian thử nghiệm (10phút, 30 phút, 1h, 2h, 24h, 48h).
Bước 3: Sợi nấm đã ngâm trong dung dịch nước hẹ được lấy ra và nuôi cấy trên môi trường GY agar. Để trong 48h trong tủ ấm ở nhiệt độ 200C
Bước 4: Đọc kết quả:
Nồng độ thấp nhất của nước ép lá hẹ có khả năng ức chế sự phát triển của nấm được dùng để làm thí nghiệm thứ 2.
Thí nghiệm 2: Xác định các nồng độ ức chế
Từ kết quả thí nghiệm 1, xác định được nồng độ thấp nhất ức chế khả năng phát triển của nấm. Nồng độ này được pha loãng ở những nồng độ khác nhau dùng để tiến hành thí nghiệm 2. TN2 được bố trí như TN1. Các nghiệm thức đối chứng không bổ sung nước ép lá hẹ. Sau 48h đọc kết quả.
Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ diệt nấm Saprolegnia tối thiểu
Những nồng độ ức chế được sự phát triển của nấm ở TN2 sẽ được để trong tủ ấm. Sau 7 ngày nồng độ thấp nhất mà nấm không thể phát triển được đó là nồng độ diệt tối thiểu.
2.4.3. Phương pháp cảm nhiễm nấm trên cá chép
2.4.3.1. Chuẩn bị cá để cảm nhiễm
Cá dùng cảm nhiễm được nuôi 1 tuần trong điều kiện bể dùng làm thí nghiệm. Trước khi cảm nhiễm cá phải được kiểm tra. Nếu không bị bệnh được dùng để cảm nhiễm.
2.4.3.2. Sản xuất bào tử nấm
- Từ đĩa GY agar có khuẩn lạc nấm phát triển, dùng dao giải phẫu cắt khối nấm nhỏ (kích thước khoảng 0,5 cm2) thả vào đĩa peptri có chứa 25ml môi trường GY broth nuôi cấy ở 250C trong 2-3 ngày.
- Dùng panh nhặt những khuẩn lạc riêng rẽ trong GY broth rửa qua nước cất khử trùng (2-3 lần), sau đó thả vào các đĩa peptri có chứa 40ml nước cất khử trùng ở nhiệt độ 250C.
- Sau 24h nuôi cấy sử dụng buồng đếm xác định nồng độ bào tử động, pha nồng độ bào tử động ở các nồng độ khác nhau để dùng cảm nhiễm.
2.4.4. Phân lập nấm
Theo phương pháp phân lập của Haita (1992) và Willoughby (1994) [22]. Có thể tiến hành phân lập nấm theo sơ đồ sau:
2.4.5. Phương pháp thử nghiệm nước ép lá hẹ (Allium tuberosum) diệt nấm Saprolegnia trên cá chép (Cyprius carpio) nấm Saprolegnia trên cá chép (Cyprius carpio)
Mẫu cá bị bệnh
Kiểm tra dưới kính hiển vi
Cắt sợi nấm
Cấy vào môi trường GY agar
Dùng phương pháp chọn một bào tử
Nấm thuần
Cá sau khi cảm nhiễm có dấu hiệu bệnh lý, phân lập được tác nhân gây bệnh thì chúng tôi tiến hành thử nghiệm nước ép lá hẹ để diệt nấm.
Thí nghiệm tiến hành trong 4 bể, mỗi bể 10 con.
Bể 1, bể 2, bể 3 sau khi đã cảm nhiễm nấm Saprolegnia thì cho nước ép lá hẹ (Alliumtuberosum) vào ngâm (Nồng độ và thời gian được xác định sau phần kết quả).
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm thường xuyên quan sát, thu mẫu và kiểm tra hàng ngày.
2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
- Xử lý số liệu trên phần mềm Ecxel.
2.6. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2.1.1. Thời gian : Từ 5/05/2008 đến 5/10/2008
2.1.2. Địa điểm: Trung tâm nghiên cứu quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực phía Bắc - Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I - Đình Bảng - Từ Sơn - Bắc Ninh
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
bể 4 (đc) bể 3
bể 2 bể 1
3.1. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM NƯỚC ÉP LÁ HẸ TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
3.1.1.Kết quả sàng lọc nồng độ của nước ép lá hẹ
Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc nồng độ của nước ép lá hẹ
Nước ép lá hẹ(%)
Sự phát triển nấm / Thời gian nuôi cấy
10 phút 30 phút 1 giờ 2 giờ 24 giờ 48 giờ
100 - - - - 50 - - - - 25 - - - - 5 + - - - - - 1 + + + + + + ĐC + + + + + +
Ghi chú : (+) : Dương tính ; (-) Âm tính
Từ kết quả sàng lọc ban đầu chúng tôi xác định được ở 5% nước ép lá hẹ ở 1h có tác dụng ức chế khả năng phát triển của nấm. Ở lô đối chứng nấm
không ngâm qua nước ép lá hẹ nấm vẫn phát triển bình thường.
Kết quả thí nghiệm các nồng độ ức chế của nước ép lá hẹ lên nấm
Saprolegnia sp được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 3.2. Khả năng ức chế của nước ép lá hẹ lên nấm Saprolegnia sp
Nồng Độ Sự phát triển của nấm/ Thời gian
1 Giờ 2 Giờ 3 Giờ 4 Giờ 24 Giờ 48 Giờ
50 000ppm - - - - - - 45 000ppm - - - - - - 40 000ppm - - - - - - 35 000ppm - - - - - - 30 000ppm - - - - - - 25 000ppm - - - - - - 20 000ppm - - - - - - 18 000ppm - - - - - - 16 000ppm - - - - - - 14 000 ppm - - - - - - 12 000 ppm + - - - - - 10 000 ppm + + + + + + 8 000 ppm + + + + + + 6 000 ppm + + + + + + 4 000 ppm + + + + + + 2 000 ppm + + + + + + ĐC + + + + + +
Qua bảng trên cho thấy nồng độ thấp nhất có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Saprolegnia là 12.000ppm ở 2h. Tuy nhiên nó chỉ có khả năng ức chế trong 48h, sang ngày thứ 3 nấm bắt đầu có hiện tượng mọc trở lại.
3.1.3.Kết quả thử nghiệm khả năng diệt nấm của nước ép lá hẹ
Bảng 3.3. Khả năng diệt nấm Saprolegnia sp của nước ép lá hẹ
Nồng Độ 3 Ngày Sự phát triển của nấm/Ngày5 Ngày 7 Ngày
50 000 ppm - - -
45 000 ppm - - -
40 000 ppm - - -
30 000 ppm - - - 25 000 ppm - - - 20 000 ppm - - - 18 000 ppm - - - 16 000 ppm - - - 14 000 ppm - - - 12 000 ppm + + + 10 000 ppm + + + ĐC + + + Xanh malachite 0,15% - - -
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm để xác định nồng độ diệt nấm tối thiểu được thể hiện ở bảng 3.3.
Sau 3 ngày thì ở nồng độ 12.000 ppm nấm Saprolegnia sp vẫn có khả năng phát triển trở lại. Còn ở những nồng độ 50.000 ppm , 45.000 ppm, 40.000 ppm , 35.000 ppm , 30.000 ppm , 25.000 ppm, 20.000 ppm, đến 14.000 ppm sau 7 ngày nấm vẫn không thể phát triển được. Nghĩa là ở những nồng độ này nước ép lá hẹ có thể tiêu diệt được nấm Saprolegnia sp. Từ kết quả của bảng 3.3 chúng tôi đã xác định được nồng độ diệt nấm tối thiểu là 14. 000ppm.
Như vậy nước ép lá hẹ có khả năng ức chế và diệt nấm Saprolegnia sp ở những nồng độ khác nhau:
- Nồng độ ức chế tối thiểu của nước ép lá hẹ lên nấm Saprolegnia là 12.000ppm ở 2h.
- Nồng độ tối thiểu diệt nấm Saprolegnia của nước ép lá hẹ là 14.000ppm.
Nước ép lá hẹ được xem như một chất kháng nấm. Từ những kết quả trên cho thấy có thể sử dụng nước ép lá hẹ để ức chế và diệt nấm Saprolegnia sp gây ra bệnh nấm thuỷ sản trên trứng và cá chép (Cyprius carpio).
Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc Bộ Môn Ngư Y- Khoa Thuỷ sản, Đại học Nông - Lâm - Huế và Bộ môn bệnh cá - Trường Đại học Nippon, Tokyo - Nhật Bản cho thấy ở 2500ppm là nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết lá trầu với dung môi là nước cất và ethanol lên sự phát triển của tất cả các nấm thuộc họ Saprolegniaceae và Achlya. Trong khi đó với nồng độ 1250ppm có khả năng ức chế nấm Aphanomycespiscida [41].
Nguyễn Ngọc Phước và ctv (2006) cũng đã ghi nhận dịch chiết từ lá Trầu có khả năng tiêu diệt các loài nấm thuộc họ Saprolegniaceae [10].
Như vậy cho thấy rằng nồng độ lá trầu có khả năng ức chế sự phát triến nấm thuộc họ Saprolegniaceae là thấp hơn nồng độ nước ép lá hẹ. Tuy nhiên các nghiên cứu trên chỉ mới tiến hành trong phòng thí nghiệm chưa thử diệt trên vật chủ mang nấm.
3.2. Hiêụ quả diệt nấm Saprolegnia sp của xanh malachite 0,15 Hình %
Hình 3.3. Sự phát triển của nấm Saprolegnia sp không ngâm qua nước ép lá hẹ
Hình 3.4. Sự phát triển của nấm Saprolegnia sp sau 48h với nước ép lá hẹ ở 8.000ppm
3.2. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM CẢM NHIỄM
Bảng 3.4. Kết quả đếm nồng độ bào tử nấm Saprolegnia sp
Số lần đếm Nồng độ bào tử/ ml 1 9 x 104 2 11 x 104 3 34 x 104 4 29 x 104 5 16 x 104 6 14 x 104 7 22 x 104 8 24 x 104 9 17 x 104 10 19 x 104 Trung bình 1,85 x 105
Nồng độ 1,85 x 105 bào tử/ml được pha loãng nồng độ ở các nồng độ khác để cảm nhiễm và kết quả cảm nhiễm được ép thể hiện ở bảng sau đây:
Bảng 3.5. Kết quả cảm nhiễm nhân tạo Nấm Saprolegnia sp lên cá chép
Thời gian (ngày)
Tỷ lệ nhiễm của cá chép khi cảm nhiễm ở các
nồng độ nấm Saprolegnia Đối chứng 1,8 x 105 1,8 x 104 1,8 x 103 1,8 x 102
1 100 30 10 0 0
2 100 50 10 0 0
3 100 50 20 0 0
Kết quả trên cho thấy tỷ lệ nhiễm nấm ở nồng độ 1,8 x 105 sau 1 ngày là 100%, 1,8 x 104bt/ml là 30%,1,8 x 103tb/ml là 10%. Sau 3 ngày tỷ lệ này tăng lên 50%, 20%. Còn ở nồng độ 1,8 x 102bt/ml thì nấm không gây ảnh hưởng đến vật chủ.
Hình 3.5. Cá bị bệnh nấm Saprolegnia Hình 3.6. Cá bị bệnh nấm Saprolegnia sau 1 ngày cảm nhiễm ở nồng độ sau 1 ngày cảm nhiễm ở nồng độ
1,8 x 105tb/ml 1,8 x 104tb/ml
3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP TÁC NHÂN GÂY BỆNH3.3.1. Dấu hiệu bệnh lý 3.3.1. Dấu hiệu bệnh lý
Sau khoảng 15h – 20h cảm nhiễm chúng tôi bắt đầu thấy trên những chỗ làm bị thương xuất hiện những sợi nấm mảnh mọc lên, sau khoảng 24h bắt đầu thấy nấm phát triển lên thành từng búi nấm trắng như bông, một đầu sợi nấm
bám vào da của cá, đầu kia tự do ngoài môi trường nước. Cá bị bệnh có hiện tượng bơi lội hỗn loạn, không bình thường, bơi sát nhau cọ xát lẫn nhau và cọ xát vào thành bể, sục khí làm tróc vẩy trầy da tạo cơ hội thuận lợi cho vi khuẩn và kí sinh trùng gây bệnh xâm nhập làm cá bị bệnh nặng hơn và tác hại sẽ nghiêm trọng thêm.
Những dấu hiệu bệnh tính ở cá chép thu được sau khi cảm nhiễm giống với dấu hiệu bệnh lý của cá bị bệnh nấm thuỷ mi tại các tỉnh phía Bắc [5].
3.3.2. Kết quả phân lập
3.3.2.1. Đặc điểm hình thái
3.3.2.1.1. Khuẩn lạc
- Tốc độ sinh trưởng khuẩn lạc: Khuẩn lạc sinh trưởng nhanh trên môi trường GY agar ở 200C, tốc độ phát triển trung bình là 3cm/ngày. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 200C đường kính khuẩn lạc đạt 8,95 cm.
- Đặc điểm khuẩn lạc: Khuẩn lạc có màu hơi trắng, sợi nấm phát triển dày đặc, nổi trên bề mặt môi trường có màu trắng bông, khuẩn lạc phát triển tròn đều.
Hình 3.7. Khuẩn lạc nấm sau 2 ngày.
3.3.2.1.2. Sợi nấm
Sợi nấm lúc đầu có màu trắng, kích thước nhỏ, chưa phân nhánh. Sau 2h nuôi cấy trong môi trường nước ao khử trùng sợi nấm bắt đầu phân nhánh. Sau đó từ đầu sợi nấm bắt đầu hình thành vách ngăn chuẩn bị tập trung nhiều nguyên sinh chất để trở thành túi bào tử.
Hình 3.8. Đầu sợi nấm bình thường Hình 3.9. Sợi nấm bắt đầu phân nhánh
Hình 3.10. Sợi nấm bắt đầu phình to Hình 3.11. Chuẩn bị xuất hiện vách ngăn
Hình 3.12. Sợi nấm phân chia vách ngăn rõ
3.3.2.1.3. Phương thức sinh sản bào tử
- Sau 2- 12h nuôi cấy trong nước ao khử trùng, nguyên sinh chất tập trung dày
đặc ở phần đỉnh đầu, đỉnh đầu phồng lớn, sinh ra vách ngăn. Nguyên sinh chất phân cắt hình thành bào tử.(hình 3.13)
3.3.2.1.4. Túi bào tử
Khi dinh dưỡng đầy đủ nấm sinh trưởng tương đối nhanh, đỉnh đầu sợi nấm phồng lớn, hút chất dinh dưỡng từ phần gốc. Sau khi hết chất dinh dưỡng nguyên sinh chất hình thành tập trung nhiều ở phần đỉnh đầu sợi nấm và đây gọi là túi bào tử.
3.3.2.1.5. Sự hình thành bào tử
- Bào tử được hình thành bên trong túi bào (Sporangium), ban đầu là sự hình thành các bào tử hình cầu dày đặc, không vận động phân bố trong túi bào tử. (Hình 3.15)
- Trước khi giải phóng, các bào tử trong túi bào tử trở thành động bào tử, có số lượng lớn vận động không định hướng trong túi bào tử. (Hình 3.16)
3.3.2.1.6. Quá trình giải phóng bào tử
Quá trình giải phóng bào tử diễn ra sau 12- 24h nuôi cấy trong môi trường nước ao khử trùng. Sau 1-2h vận động hỗn loạn trong túi bào tử, sau đó bào tử phá một lỗ nhỏ ở phần đỉnh túi bào tử, bào tử được giải phóng ra.
Hình 3.14. Túi bào tử chứa nguyên Hình 3.15. Túi bào tử chứa các bào sinh chất.(x100) tử hình cầu không vận động.(x100)
Hình 3.16. Các bào tử phân chia Hình 3.17.Các bào tử chuẩn bị được rõ rệt, chuyển động trong túi bào tử. giải phóng ra khỏi túi bào tử
3.3.2.2. Đặc điểm của nấm
3.3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của khuẩn lạc nấm
Bảng 3.6. Kết quả phân tích anova của yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng tới sự phát triển của khuẩn lạc nấm
Nhiệt độ (0C) Đường kính khuẩn lạc nấm (cm) LSD0.05 5 0.0 ± 0.0 c 10 3.2 ± 0.1 b 15 8.7 ± 0.26 a 20 9 ± 0.18 a 25 8.5 ± 0.1 a 30 7.6 ± 0.2 d 35 4.3 ± 0.1 e 40 2.1 ± 0.1 f
Hình 3.20. Tốc độ sinh trưởng của nấm ở các nhiệt độ khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường GY agar
Qua kết quả phân tích Anova và bảng so sánh LSD0,05 cho thấy có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 về sự phát triển của khuẩn lạc nấm ở các nhiệt độ khác nhau. Khuẩn lạc nấm phát triển tối ưu ở khoảng 150C –
250C, phát triển tốt nhất ở 200C, trung bình 24h ở 200C đường kính khuẩn lạc