2.1.1. Thời gian : Từ 5/05/2008 đến 5/10/2008
2.1.2. Địa điểm: Trung tâm nghiên cứu quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực phía Bắc - Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I - Đình Bảng - Từ Sơn - Bắc Ninh
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
bể 4 (đc) bể 3
bể 2 bể 1
3.1. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM NƯỚC ÉP LÁ HẸ TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
3.1.1.Kết quả sàng lọc nồng độ của nước ép lá hẹ
Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc nồng độ của nước ép lá hẹ
Nước ép lá hẹ(%)
Sự phát triển nấm / Thời gian nuôi cấy
10 phút 30 phút 1 giờ 2 giờ 24 giờ 48 giờ
100 - - - - 50 - - - - 25 - - - - 5 + - - - - - 1 + + + + + + ĐC + + + + + +
Ghi chú : (+) : Dương tính ; (-) Âm tính
Từ kết quả sàng lọc ban đầu chúng tôi xác định được ở 5% nước ép lá hẹ ở 1h có tác dụng ức chế khả năng phát triển của nấm. Ở lô đối chứng nấm
không ngâm qua nước ép lá hẹ nấm vẫn phát triển bình thường.
Kết quả thí nghiệm các nồng độ ức chế của nước ép lá hẹ lên nấm
Saprolegnia sp được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 3.2. Khả năng ức chế của nước ép lá hẹ lên nấm Saprolegnia sp
Nồng Độ Sự phát triển của nấm/ Thời gian
1 Giờ 2 Giờ 3 Giờ 4 Giờ 24 Giờ 48 Giờ
50 000ppm - - - - - - 45 000ppm - - - - - - 40 000ppm - - - - - - 35 000ppm - - - - - - 30 000ppm - - - - - - 25 000ppm - - - - - - 20 000ppm - - - - - - 18 000ppm - - - - - - 16 000ppm - - - - - - 14 000 ppm - - - - - - 12 000 ppm + - - - - - 10 000 ppm + + + + + + 8 000 ppm + + + + + + 6 000 ppm + + + + + + 4 000 ppm + + + + + + 2 000 ppm + + + + + + ĐC + + + + + +
Qua bảng trên cho thấy nồng độ thấp nhất có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Saprolegnia là 12.000ppm ở 2h. Tuy nhiên nó chỉ có khả năng ức chế trong 48h, sang ngày thứ 3 nấm bắt đầu có hiện tượng mọc trở lại.
3.1.3.Kết quả thử nghiệm khả năng diệt nấm của nước ép lá hẹ
Bảng 3.3. Khả năng diệt nấm Saprolegnia sp của nước ép lá hẹ
Nồng Độ 3 Ngày Sự phát triển của nấm/Ngày5 Ngày 7 Ngày
50 000 ppm - - -
45 000 ppm - - -
40 000 ppm - - -
30 000 ppm - - - 25 000 ppm - - - 20 000 ppm - - - 18 000 ppm - - - 16 000 ppm - - - 14 000 ppm - - - 12 000 ppm + + + 10 000 ppm + + + ĐC + + + Xanh malachite 0,15% - - -
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm để xác định nồng độ diệt nấm tối thiểu được thể hiện ở bảng 3.3.
Sau 3 ngày thì ở nồng độ 12.000 ppm nấm Saprolegnia sp vẫn có khả năng phát triển trở lại. Còn ở những nồng độ 50.000 ppm , 45.000 ppm, 40.000 ppm , 35.000 ppm , 30.000 ppm , 25.000 ppm, 20.000 ppm, đến 14.000 ppm sau 7 ngày nấm vẫn không thể phát triển được. Nghĩa là ở những nồng độ này nước ép lá hẹ có thể tiêu diệt được nấm Saprolegnia sp. Từ kết quả của bảng 3.3 chúng tôi đã xác định được nồng độ diệt nấm tối thiểu là 14. 000ppm.
Như vậy nước ép lá hẹ có khả năng ức chế và diệt nấm Saprolegnia sp ở những nồng độ khác nhau:
- Nồng độ ức chế tối thiểu của nước ép lá hẹ lên nấm Saprolegnia là 12.000ppm ở 2h.
- Nồng độ tối thiểu diệt nấm Saprolegnia của nước ép lá hẹ là 14.000ppm.
Nước ép lá hẹ được xem như một chất kháng nấm. Từ những kết quả trên cho thấy có thể sử dụng nước ép lá hẹ để ức chế và diệt nấm Saprolegnia sp gây ra bệnh nấm thuỷ sản trên trứng và cá chép (Cyprius carpio).
Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc Bộ Môn Ngư Y- Khoa Thuỷ sản, Đại học Nông - Lâm - Huế và Bộ môn bệnh cá - Trường Đại học Nippon, Tokyo - Nhật Bản cho thấy ở 2500ppm là nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết lá trầu với dung môi là nước cất và ethanol lên sự phát triển của tất cả các nấm thuộc họ Saprolegniaceae và Achlya. Trong khi đó với nồng độ 1250ppm có khả năng ức chế nấm Aphanomycespiscida [41].
Nguyễn Ngọc Phước và ctv (2006) cũng đã ghi nhận dịch chiết từ lá Trầu có khả năng tiêu diệt các loài nấm thuộc họ Saprolegniaceae [10].
Như vậy cho thấy rằng nồng độ lá trầu có khả năng ức chế sự phát triến nấm thuộc họ Saprolegniaceae là thấp hơn nồng độ nước ép lá hẹ. Tuy nhiên các nghiên cứu trên chỉ mới tiến hành trong phòng thí nghiệm chưa thử diệt trên vật chủ mang nấm.
3.2. Hiêụ quả diệt nấm Saprolegnia sp của xanh malachite 0,15 Hình %
Hình 3.3. Sự phát triển của nấm Saprolegnia sp không ngâm qua nước ép lá hẹ
Hình 3.4. Sự phát triển của nấm Saprolegnia sp sau 48h với nước ép lá hẹ ở 8.000ppm
3.2. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM CẢM NHIỄM
Bảng 3.4. Kết quả đếm nồng độ bào tử nấm Saprolegnia sp
Số lần đếm Nồng độ bào tử/ ml 1 9 x 104 2 11 x 104 3 34 x 104 4 29 x 104 5 16 x 104 6 14 x 104 7 22 x 104 8 24 x 104 9 17 x 104 10 19 x 104 Trung bình 1,85 x 105
Nồng độ 1,85 x 105 bào tử/ml được pha loãng nồng độ ở các nồng độ khác để cảm nhiễm và kết quả cảm nhiễm được ép thể hiện ở bảng sau đây:
Bảng 3.5. Kết quả cảm nhiễm nhân tạo Nấm Saprolegnia sp lên cá chép
Thời gian (ngày)
Tỷ lệ nhiễm của cá chép khi cảm nhiễm ở các
nồng độ nấm Saprolegnia Đối chứng 1,8 x 105 1,8 x 104 1,8 x 103 1,8 x 102
1 100 30 10 0 0
2 100 50 10 0 0
3 100 50 20 0 0
Kết quả trên cho thấy tỷ lệ nhiễm nấm ở nồng độ 1,8 x 105 sau 1 ngày là 100%, 1,8 x 104bt/ml là 30%,1,8 x 103tb/ml là 10%. Sau 3 ngày tỷ lệ này tăng lên 50%, 20%. Còn ở nồng độ 1,8 x 102bt/ml thì nấm không gây ảnh hưởng đến vật chủ.
Hình 3.5. Cá bị bệnh nấm Saprolegnia Hình 3.6. Cá bị bệnh nấm Saprolegnia sau 1 ngày cảm nhiễm ở nồng độ sau 1 ngày cảm nhiễm ở nồng độ
1,8 x 105tb/ml 1,8 x 104tb/ml
3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP TÁC NHÂN GÂY BỆNH3.3.1. Dấu hiệu bệnh lý 3.3.1. Dấu hiệu bệnh lý
Sau khoảng 15h – 20h cảm nhiễm chúng tôi bắt đầu thấy trên những chỗ làm bị thương xuất hiện những sợi nấm mảnh mọc lên, sau khoảng 24h bắt đầu thấy nấm phát triển lên thành từng búi nấm trắng như bông, một đầu sợi nấm
bám vào da của cá, đầu kia tự do ngoài môi trường nước. Cá bị bệnh có hiện tượng bơi lội hỗn loạn, không bình thường, bơi sát nhau cọ xát lẫn nhau và cọ xát vào thành bể, sục khí làm tróc vẩy trầy da tạo cơ hội thuận lợi cho vi khuẩn và kí sinh trùng gây bệnh xâm nhập làm cá bị bệnh nặng hơn và tác hại sẽ nghiêm trọng thêm.
Những dấu hiệu bệnh tính ở cá chép thu được sau khi cảm nhiễm giống với dấu hiệu bệnh lý của cá bị bệnh nấm thuỷ mi tại các tỉnh phía Bắc [5].
3.3.2. Kết quả phân lập
3.3.2.1. Đặc điểm hình thái
3.3.2.1.1. Khuẩn lạc
- Tốc độ sinh trưởng khuẩn lạc: Khuẩn lạc sinh trưởng nhanh trên môi trường GY agar ở 200C, tốc độ phát triển trung bình là 3cm/ngày. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 200C đường kính khuẩn lạc đạt 8,95 cm.
- Đặc điểm khuẩn lạc: Khuẩn lạc có màu hơi trắng, sợi nấm phát triển dày đặc, nổi trên bề mặt môi trường có màu trắng bông, khuẩn lạc phát triển tròn đều.
Hình 3.7. Khuẩn lạc nấm sau 2 ngày.
3.3.2.1.2. Sợi nấm
Sợi nấm lúc đầu có màu trắng, kích thước nhỏ, chưa phân nhánh. Sau 2h nuôi cấy trong môi trường nước ao khử trùng sợi nấm bắt đầu phân nhánh. Sau đó từ đầu sợi nấm bắt đầu hình thành vách ngăn chuẩn bị tập trung nhiều nguyên sinh chất để trở thành túi bào tử.
Hình 3.8. Đầu sợi nấm bình thường Hình 3.9. Sợi nấm bắt đầu phân nhánh
Hình 3.10. Sợi nấm bắt đầu phình to Hình 3.11. Chuẩn bị xuất hiện vách ngăn
Hình 3.12. Sợi nấm phân chia vách ngăn rõ
3.3.2.1.3. Phương thức sinh sản bào tử
- Sau 2- 12h nuôi cấy trong nước ao khử trùng, nguyên sinh chất tập trung dày
đặc ở phần đỉnh đầu, đỉnh đầu phồng lớn, sinh ra vách ngăn. Nguyên sinh chất phân cắt hình thành bào tử.(hình 3.13)
3.3.2.1.4. Túi bào tử
Khi dinh dưỡng đầy đủ nấm sinh trưởng tương đối nhanh, đỉnh đầu sợi nấm phồng lớn, hút chất dinh dưỡng từ phần gốc. Sau khi hết chất dinh dưỡng nguyên sinh chất hình thành tập trung nhiều ở phần đỉnh đầu sợi nấm và đây gọi là túi bào tử.
3.3.2.1.5. Sự hình thành bào tử
- Bào tử được hình thành bên trong túi bào (Sporangium), ban đầu là sự hình thành các bào tử hình cầu dày đặc, không vận động phân bố trong túi bào tử. (Hình 3.15)
- Trước khi giải phóng, các bào tử trong túi bào tử trở thành động bào tử, có số lượng lớn vận động không định hướng trong túi bào tử. (Hình 3.16)
3.3.2.1.6. Quá trình giải phóng bào tử
Quá trình giải phóng bào tử diễn ra sau 12- 24h nuôi cấy trong môi trường nước ao khử trùng. Sau 1-2h vận động hỗn loạn trong túi bào tử, sau đó bào tử phá một lỗ nhỏ ở phần đỉnh túi bào tử, bào tử được giải phóng ra.
Hình 3.14. Túi bào tử chứa nguyên Hình 3.15. Túi bào tử chứa các bào sinh chất.(x100) tử hình cầu không vận động.(x100)
Hình 3.16. Các bào tử phân chia Hình 3.17.Các bào tử chuẩn bị được rõ rệt, chuyển động trong túi bào tử. giải phóng ra khỏi túi bào tử
3.3.2.2. Đặc điểm của nấm
3.3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của khuẩn lạc nấm
Bảng 3.6. Kết quả phân tích anova của yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng tới sự phát triển của khuẩn lạc nấm
Nhiệt độ (0C) Đường kính khuẩn lạc nấm (cm) LSD0.05 5 0.0 ± 0.0 c 10 3.2 ± 0.1 b 15 8.7 ± 0.26 a 20 9 ± 0.18 a 25 8.5 ± 0.1 a 30 7.6 ± 0.2 d 35 4.3 ± 0.1 e 40 2.1 ± 0.1 f
Hình 3.20. Tốc độ sinh trưởng của nấm ở các nhiệt độ khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường GY agar
Qua kết quả phân tích Anova và bảng so sánh LSD0,05 cho thấy có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 về sự phát triển của khuẩn lạc nấm ở các nhiệt độ khác nhau. Khuẩn lạc nấm phát triển tối ưu ở khoảng 150C –
250C, phát triển tốt nhất ở 200C, trung bình 24h ở 200C đường kính khuẩn lạc phát triển được 3cm và khuẩn lạc nấm phát triển kém ở nhiệt độ100C, 350C, 400C còn ở 50C khuẩn lạc nấm hoàn toàn không phát triển.
3.3.2.2.2. Ảnh hưởng của độ muối đến sự sinh trưởng của khuẩn lạc nấm
* Ảnh hưởng của các nồng độ muối NaCl
Bảng 3.7. Kết quả phân tích anova của các nồng độ NaCl ảnh hưởng đến sự phát triển của khuẩn lạc nấm Saprolegnia
Nồng độ
NaCl (%) Đường kính khuẩn lạc (cm) LSD0.05
4 0 ± 0 a 3 0 ± 0 a 2 3.1 ± 0.256 b 1.5 5.2 ± 0.529 c 1 7.7 ± 0.436 d 0.5 9 ± 0.05e
Hình 3.21. Tốc độ sinh trưởng của nấm sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường GY agar chứa các nồng độ NaCl khác nhau.
Qua kết quả phân tích Anova và bảng so sánh LSD0,05 cho thấy có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 về sự phát triển của khuẩn lạc nấm ở các nồng độ muối NaCl khác nhau. Khuẩn lạc nấm phát triển tốt nhất trên môi trường GY agar cũng như GY agar chứa 0,5% NaCl, càng tăng nồng độ NaCl thì khuẩn lạc càng kém phát triển. Ở NaCl > 3% thì khuẩn lạc nấm hoàn toàn không phát triển.
* Ảnh hưởng của các nồng độ muối KCl
Bảng 3.8. Kết quả phân tích anova của yếu tố muối KCl ảnh hưởng tới sự phát triển của khuẩn lạc nấm Saprolegnia
Nồng độ KCl (%) Đường kính khuẩn lạc nấm (cm) LSD0.05 4.5 0 ± 0 f 0.284 4 2.1 ± 0.1 e 3 5.3 ± 0.05 d 2 6.1 ± 0.1 c 1.5 7.2 ± 0.1 b 1 8.9 ± 0.1a 0.5 8.9 ± 0.1a
Hình 3.22. Tốc độ sinh truởng của khuẩn lạc nấm sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường GY agar chứa các nồng độ muối KCl khác nhau.
Qua kết quả phân tích Anova và bảng so sánh LSD0,05 cho thấy ở nồng độ muối KCl khác nhau thì có sự khác nhau về sự phát triển của khuẩn lạc với mức ý nghĩa thống kê P < 0,05. Khuẩn lạc nấm phát triển tốt trên môi trường GY agar có bổ sung thêm 0,5%; 1% KCl, phát triển kém trên môi trường GY agar có bổ sung thêm 1,5% - 4% KCl và không phát triển khi bổ sung thêm 4,5%KCl.
Từ những kết quả đã phân lập trên chúng tôi kết luận rằng tác nhân gây bệnh là giống nấm saprolegnia.
Theo Lê Văn Khoa (2006). Đây là một loài nấm gây bệnh phổ biến trong môi trường nước ngọt, gây bệnh nấm thuỷ mi ở cá nước ngọt, bệnh rất dễ lây lan, khó phát hiện gây thiệt hại lớn cho người nuôi [6].
Rechenbach - Klinke (1966) nấm bậc thấp thường hay gây ra các bệnh trên cá nước ngọt. Tuy nhiên chỉ là những cá đã bị suy nhược hoặc tổn thương mới mắc bệnh vì trên da cá khỏe mạnh thì các bào tử không thể nảy mầm được. Trong số các tác nhân gây bệnh thì Saprolegnia và Achlya là phổ biến nhất [35].
3.4. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM NƯỚC ÉP LÁ HẸ (Allium tuberosum) DIỆT NẤM SAPROLEGNIA TRÊN CÁ CHÉP
Từ kết quả cảm nhiễm nấm chúng tôi tiến hành thí nghiệm diệt nấm bằng nước ép lá hẹ kết quả được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.10. Tỷ lệ sống của cá chép sau khi điều trị bằng nước ép lá hẹ
Nồng độ Tỷ lệ sống của cá chép thí nghiệm Bể 1 (1,8 x 105) Bể 2 (1,8 x 104) Bể 3 (1,8 x 103) Bể đối chứng 14. 000ppm 90% 100% 100% 10%
Bể 1 sau 1 ngày cảm nhiễm, bể 2 và bể 3 sau 3 ngày cảm nhiễm thì chúng tôi tiến hành ngâm nước ép lá hẹ ở nồng độ 14.000ppm trong 30 phút. Kết quả của 3 bể như sau:
- Bể 1: Sau 2 ngày theo dõi thấy có 1 con bị chết, do cá bị nhiễm nặng quá không thể điều trị được, 9 con còn lại thấy không còn dấu hiệu của nấm nữa, cá bơi lội và ăn bình thường.
- Bể 2 và 3: Sau 2 ngày điều trị thấy toàn bộ cá đều không có dấu hiệu của bệnh, cá bơi lội và ăn bình thường.
- Bể đối chứng: Cá bị nhiễm nấm nhưng không điều trị bằng nước ép lá hẹ. Sau 2 ngày toàn bộ cá bị chết.
Sau 7 ngày theo dõi không có hiện tượng cá có bệnh trở lại và không có con nào chết.Chúng tôi tiến hành lấy vây, vảy cấy trên môi trường GY agar nhưng hoàn toàn không có dấu hiệu của nấm.
Như vậy chứng tỏ nước ép lá hẹ có tác dụng điều trị bệnh do nấm
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Nước ép lá hẹ có khả năng kháng nấm Saprolegnia. sp gây bệnh nấm thuỷ mi trên cá chép.
2. Nồng độ nước ép lá hẹ tối thiểu ức chế nấm Saprolegnia. sp là 12.000ppm. 3. Nồng độ nước ép lá hẹ tối thiểu diệt nấm Saprolegnia. sp là 14.000ppm. 4. Trên đối tượng cá chép nhiễm nấm Saprolegnia sp sử dụng nước ép lá hẹ thì nấm bị tiêu diệt và không tái nhiễm trở lại sau thời gian 7 ngày.
5. Kết quả diệt nấm Saprolegnia sp của nước ép lá hẹ ở cá chép cho tỷ lệ sống từ 90% - 100% so với cá chép không tắm qua nước ép lá hẹ là 10%.
Kiến nghị
1. Nên sử dụng nước ép lá hẹ trong việc điều trị bệnh do nấm Saprolegnia.sp