3.đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.2 Phương pháp gây nhiễm virus trên môi trường tế bào xơ phôi gà 1 lớp
Dùng trứng gà có phôi ựã ấp ựược 9 ngày (Giống Leghorn) tiến hành theo các bước sau:
+ Soi ựể chọn những quả có phôi sống khoẻ.
+ Giết lạnh phôi ựồng thời làm co mạch máu, tiêu ựộc trứng, gắp phôi ra ựĩa Petrị
+ Rửa bằng dung dịch PBS- 3 lần.
+ Cắt nhỏ phôi và rửa phôi trên máy khuấy từ 2 lần
+ Rửa tiếp bằng dung dịch Trypsin 0,125%.
+ Hút bỏ phần nước trong ở trên.
+ Tách tế bào bằng dung dịch Trypsin 0,25% trên máy khuấy từ trong
phòng ấm 370C .
+ Lọc tế bào qua lưới lọc và ly tâm lạnh với tốc ựộ 2000 vòng/phút .
+ Chắt bỏ nước trong, dùng môi trường phát triển ựể pha loãng tế bàọ
+ đếm tế bào trên buồng ựếm hồng cầu, ựịnh lượng tế bào .
+ Pha tế bào thành nồng ựộ 0,5% (tương ựương 75x104 tế bào /ml), chia tế bào ra các chai nuôi và ựặt trong phòng ấm 370C.
+ Hàng ngày quan sát khả năng phát triển của tế bào xơ phôi gà trong các chai tế bào trên kắnh hiển vi soi ngược.
3.4.2 Phương pháp gây nhiễm virus trên môi trường tế bào xơ phôi gà 1 lớp lớp
- Sản xuất tế bào xơ phôi gà một lớp.
- Khi tế bào trong môi trường nuôi phát triển phủ kắn trên 80% diện tắch mặt chai nuôi thì ựược gây nhiễm virus.
- Dùng môi trường Eagle MEM pha loãng giống virus, sau ựó gây nhiễm vào các chai ựã có tế bào phát triển tốt. Nuôi cấy tiếp ở 370C.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ. 36
+ Hàng ngày quan sát bằng kắnh hiển vi soi ngược ựể phát hiện bệnh tắch tế bào (CPE). Sau khi gây nhiễm virus nhân lên và gây bệnh lý tế bào trên 80% thì tiến hành thu hoạch huyễn dịch (bán thành phẩm ). + Lấy mẫu bán thành phẩm kiểm tra vô trùng, chuẩn ựộ hiệu giá virus. Trong thời gian kiểm tra phải bảo quản huyễn dịch ựó trong tủ lạnh âm 45oC.