III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ
3.1.1. Nguồn nấm Pyricularia oryzae
Vụðụng xuõn năm 2008-2009 chỳng tụi ủó thu thập cỏc mẫu bệnh ủạo ụn (cả ủạo ụn lỏ và ủạo ụn cổ bụng) trờn một số giống lỳa ở cỏc ủịa phương
ủại diện cho cỏc vựng sinh thỏi khỏc nhau ở Quảng Bỡnh. Cỏc mẫu thu thập về ủược hong khụ trong phũng nhờ giú rồi ủưa về phũng thớ nghiệm JICA- trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội tiến hành phõn lập bằng phương phỏp cấy ủơn bào tử. Kết quả phõn lập ủược cỏc isolates khỏc nhau và sử dụng cỏc mẫu phõn lập này làm nguồn ủể xỏc ủịnh chủng sinh lý của bệnh ủạo ụn ở
Quảng Bỡnh.
Nguồn nấm Pyricularia oryzae thu thập ủể phõn lập. TT Kớ hiệu mẫu Từ giống lỳa ðịa ủiểm lấy mẫu 1 QB1 BC 15 Phong Thủy- Lệ Thuỷ- Quảng Bỡnh 2 QB2 VN20 Hàm Ninh- Quảng Ninh- Quảng Bỡnh 3 QB3 Xi23 Quảng Long- Quảng Trạch- Quảng Bỡnh 4 QB4 P6 Hàm Ninh- Quảng Ninh- Quảng Bỡnh 3.1.2. Bộ giống chỉ thị:
Gồm 12 giống: K59, Shin 2, Aichi-asahi, Ishikari-Shrroke, Kanto 51, K60, Tsuyuate, Fukunishiki, Yashiromichi, Pi. No 4, Toride 1, BL1.
3.1.3. Hoỏ chất và cỏc nguyờn vật liệu khỏc dựng trong thớ nghiệm:
Cồn 960, Tween 20, Khoai tõy, ủường saccaroza, ủường Gluco, cỏm gạo, agar...
3.1.4. Mụi trường nhõn tạo ủể nuụi cấy nấm
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………38 - Mụi trường WA (Water Agar) dựng ủể bắt bào tử khi phõn lập nấm Thành phần gồm:
Agar: 20 gam nước cất: 1.000 ml
- Mụi trường PSA (Potato Sugar Agar) dựng ủể giữ nguồn nấm Thành phần gồm:
Khoai tõy: 200 gam
ðường Saccaroza: 20 gam Agar: 20 gam nước cất: 1.000 ml
- Mụi trường cỏm agar dựng sản xuất bào tử ủể lõy nhiễm - Thành phần gồm:
Cỏm gạo: 20 gam
ðường Saccaroza: 5 gam Agar: 20 gam Nước cất: 1.000 ml
3.1.5. Dụng cụ thớ nghiệm
- Kớnh hiển vi, ủĩa petri, bỡnh tam giỏc, ống nghiệm, panh, ủũa thuỷ
tinh, lamen, bỡnh tia, lam kớnh, chổi lụng, nồi hấp, bỡnh phun - Buồng cấy nấm, buồng sỏng
3.2. ðịa ủiểm nghiờn cứu
3.2.1 Nghiờn cứu ngoài ủồng
- Trờn ủồng ruộng chỳng tụi tiến hành ủiều tra, nghiờn cứu ở cỏc ủịa phương
ủại diện cho một số vựng sinh thỏi khỏc nhau ở Quảng Bỡnh:
- Vựng ủất cỏt gần biển: Chọn Xó Quảng Phỳc huyện Quảng Trạch ủể
nghiờn cứu với những nột ủặc trưng là: ủất cỏt nặng, trỡnh ủộ canh tỏc của nụng dõn lạc hậu, ớt ủầu tư, gieo sạ nhiều giống nhiễm bệnh (IR38) và là vựng thường bị
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………39 - Vựng ủồng bằng: Chọn xó Quảng Thanh huyện Quảng Trạch với những nột ủặc trưng là ủất thịt nặng, nằm giữa nỳi và biển, trỡnh
ủộ thõm canh cao, nụng dõn nắm nhiều tiến bộ KHKT
- Vựng trũng: Chọn xó ðức Ninh- ðồng Hới với những nột ủặc trưng là
ủất trũng, nhiều ruộng bị lầy thụt; trỡnh ủộ thõm canh tốt
- Vựng ủồng bằng gần biển: Chọn xó Hàm Ninh huyện Quảng Ninh với những nột ủặc trưng là ủất thịt nhẹ, gieo sạ nhiều giống nhiễm bệnh (VN20) và thường bịủạo ụn gõy hại hàng năm.
- Vựng phự sa thuần lỳa: Chọn xó Phong Thủy huyện Lệ Thủy ủại diện cho vựng
ủất màu mỡ, thuần lỳa, thõm canh tốt
3.2.2. Nghiờn cứu trong nhà lưới
- Tại nhà lưới của Bộ mụn Bệnh cõy- Khoa Nụng học- Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội.
3.2.3. Nghiờn cứu trong phũng thớ nghiệm
- Tại phũng thớ nghiệm JICA- Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội.
3.3. Nội dung nghiờn cứu
3.3.1. Nghiờn cứu ngoài ủồng ruộng
- Sự phỏt triển của bệnh ủạo ụn qua cỏc giai ủoạn phỏt triển của lỳa gieo thẳng vụðụng xuõn 2008-2009 ở Quảng Bỡnh.
- Ảnh hưởng của vựng sinh thỏi ủến bệnh ủạo ụn hại lỳa gieo thẳng vụ ðụng xuõn 2008-2009 ở Quảng Bỡnh
- Tớnh khỏng nhiễm bệnh ủạo ụn của một số giống lỳa gieo thẳng phổ
biến trong vụðụng xuõn 2008-2009 ở Quảng Bỡnh
- Ảnh hưởng của kỹ thuật ICM ủến bệnh ủạo ụn hại lỳa trong vụ ðụng xuõn 2008-2009 ở Quảng Bỡnh
- Xỏc ủịnh sự tương quan giữa cỏc yếu tố sinh thỏi kỹ thuật ủến bệnh
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………40
3.3.2. Nghiờn cứu trong phũng thớ nghiệm
- Phõn lập nấm Pyricularia oryzae từ cỏc mẫu bệnh thu thập ở cỏc ủịa phương, nuụi cấy trờn mụi trường PSA ủể thu ủược nấm thuần.
- Chẩn ủoỏn và xỏc ủịnh nũi nấm Pyricularia oryzae
3.3.3. Nghiờn cứu trong nhà lưới
- Từ cỏc mẫu phõn lập (isolate) của nấm Pyricularia oryzae gõy bệnh
ủạo ụn (phõn lập từ cỏc mẫu bệnh thu thập ủược tại tỉnh Quảng Bỡnh trong vụ ðụng Xuõn 2008-2009) ủó phõn lập ủược ở trong phũng thớ nghiệm, tiến hành lõy nhiễm nhõn tạo trờn 12 giống lỳa chỉ thị của Nhật Bản ủể xỏc ủịnh:
+ Cấp bệnh của cỏc giống chỉ thị.
+ Mức ủộ khỏng nhiễm của cỏc giống chỉ thị.
+ Xỏc ủịnh chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae ủó ủược phõn lập.
3.4. Phương phỏp nghiờn cứu
3.4.1. Nghiờn cứu ngoài ủồng ruộng 3.4.1.1.ðiều tra ngoài ủồng ruộng 3.4.1.1.ðiều tra ngoài ủồng ruộng
* ðiều tra tỡnh hỡnh bệnh.
- Ruộng ủiều tra: trờn mỗi giống; mỗi vựng sinh thỏi; mỗi phương thức canh tỏc chọn 3 ruộng ủại diện ủể ủiều tra.
- ðiểm ủiều tra: Mỗi ruộng ủiều tra theo 5 ủiểm chộo gúc, mỗi ủiểm
ủiều tra 10 khúm, mỗi khúm 1 dảnh, cõy ủiều tra ủầu tiờn cỏch bờ ớt nhất 2 m. - Chỉ tiờu ủiều tra: Số lỏ, bụng bị bệnh; phõn cấp lỏ, bụng bị bệnh ủể
tớnh tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh. - Thời kỳủiều tra:
+ Giai ủoạn lỳa ủẻ nhỏnh + Giai ủoạn lỳa ủứng cỏi + Giai ủoạn lỳa ủũng non + Giai ủoạn ủũng già
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………41 * ðiều tra diễn biến bệnh
- Ruộng ủiều tra: Trờn giống lỳa VN20 chọn 3 ruộng ở Hàm Ninh- Quảng Ninh (vựng ủồng bằng gần biển) và giống IR 38 chọn 3 ruộng ở Quảng Phỳc- Quảng Trạch (vựng ủất cỏt gần biển) ủểủiều tra.
- ðiểm ủiều tra: Mỗi ruộng ủiều tra 5 ủiểm chộo gúc, mỗi ủiểm ủiều tra 10 khúm, mỗi khúm 1 dảnh, cõy ủiều tra ủầu tiờn cỏch bờ ớt nhất 2 m.
- Chỉ tiờu ủiều tra: Số lỏ, bụng bị bệnh; phõn cấp lỏ, bụng bị bệnh; tớnh tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh.
- Thời gian ủiều tra: 7 ngày/1 lần. 3.4.1.2. Phõn cấp bệnh ủạo ụn
* Phõn cấp bệnh trờn lỏ
Cấp 0: Khụng cú cấp bệnh trờn lỏ.
Cấp 1: Cỏc vết bệnh màu nõu, nhỏ như mũi kim, khụng cú vựng sinh bào tử.
Cấp 2: Vết bệnh nhỏ, trũn hoặc hỡnh thoi dài, ủường kớnh 1 - 2 mm, cú viền nõu rừ rệt, hầu hết cỏc lỏ dưới ủều cú vết bệnh. Cấp 3: Vết bệnh tương tự như cấp 2, nhưng cỏc lỏ phớa trờn cũng bị bệnh. Cấp 4: Vết bệnh cú dạng hỡnh thoi ủiển hỡnh, dài từ 3 mm trở lờn, diện tớch bị bệnh ở cỏc lỏ dưới nhỏ hơn 4% diện tớch lỏ. Cấp 5: Vết bệnh ủiển hỡnh, cỏc vết bệnh cú thể liờn kết với nhau, diện tớch vết bệnh từ 4-10% diện tớch lỏ. Cấp 6: Diện tớch vết bệnh từ 10 - 25% diện tớch lỏ. Cấp 7: Diện tớch vết bệnh chiếm từ 26 - 50% diện tớch lỏ. Cấp 8: Diện tớch vết bệnh chiếm từ 51 - 75% diện tớch lỏ. Cấp 9: Diện tớch vết bệnh chiếm trờn 75% diện tớch lỏ. * Phõn cấp bệnh trờn bụng Cấp 0: Khụng cú vết bệnh trờn bụng. Cấp 3: Vết bệnh trờn một vài giộ sơ cấp hoặc phần giữa của trục bụng.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………42
Cấp 5: Vết bệnh bao quanh một phần gốc bụng (ủốt) hoặc phần ống rạ
phớa dưới của trục bụng.
Cấp 7: Vết bệnh bao quanh toàn bộ cổ bụng hoặc một phần trục bụng gần cổ bụng, trờn bụng cú 30% số hạt chắc trở lờn.
Cấp 9: Toàn bộ bụng bị bệnh, số hạt chắc trờn bụng dưới 30%.
3.4.2. Phương phỏp nghiờn cứu trong phũng
3.4.2.1. Phõn lập nấm theo phương phỏp cấy ủơn bào tử
- Mẫu bệnh khụ ủem rửa sạch, lau khụ sau ủú cắt một ủoạn cả phần mụ khoẻ và mụ bị bệnh ủặt trong ủĩa petri cú giấy lọc ẩm, ủậy nắp, ủểủĩa ở nhiệt
ủộ phũng khoảng 1 - 2 ngày ủể cho nấm bệnh mọc.
+ Lấy ủĩa WA (Water agar), cầm ỳp mặt thạch phớa dưới, gấp ủoạn lỏ hoặc cổ bụng cú vết bệnh, dựng panh cặp và ủặt cho bào tử ở vết bệnh dớnh vào bề mặt thạch, dựng bỳt dạ khoanh khu vực ủặt vết bệnh ủể khi ủưa lờn kớnh hiển vi dễ quan sỏt bào tử.
+ Khử trựng kim thuỷ tinh bằng cồn
+ ðưa ủĩa WA cú bào tử lờn kớnh hiển vi, quan sỏt và khờu bào tử vào
ủầu kim thuỷ tinh (ủiều chỉnh kớnh và kim thuỷ tinh chớnh xỏc sao cho mỗi lần khờu lấy một bào tử). Vặn vật kớnh lờn cao, ủưa ủĩa WA ra và cho ủĩa PSA vào theo chiều ỳp mặt thạch xuống phớa dưới, dựng bỳt dạ khoanh trũn 4- 5 khoanh của ủĩa, rồi từ từ thả bào tử từ ủầu kim thuỷ tinh vào nơi cú ủỏnh dấu khoanh trũn trờn ủĩa PSA. Mỗi khoanh trũn thả một bào tử (mỗi ủĩa PSA thả 4 bào tử)
+ ðậy nắp ủĩa lại và ủặt vào tủ ủịnh ụn. Sau 3- 4 ngày bào tử phỏt triển thành tản nấm, dựng que cấy nấm (ủó ủược vụ trựng) lấy một mẩu thạch cú sợi nấm non cấy vào ống nghiệm mụi trường PSA nghiờng ủể giữ nguồn ủể nghiờn cứu.
* Chuẩn bị mụi trường nghiờn cứu 3 loại mụi trường: WA, PSA và cỏm Agar.
Cỏch nấu mụi trường: Bước 1: Chuẩn bịủĩa petri
- Rửa sạch ủĩa bằng nước mỏy tiếp theo khử trựng khụ trong tủ sấy ở
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………43
Bước 2: Nấu mụi trường
+ Mụi trường PSA: Dựng 1kg khoai tõy gọt sạch vỏ, cắt thành từng lỏt mỏng + 1 lớt nước ủun sụi khoảng 30 phỳt sau ủú dựng lớp vải màn ủụi lọc thu
ủược nước khoai tõy (PB: Potato Broth). Lấy PB ủun sụi, cho vào ủú 20g ủường
ăn + 20g agar, ủổ thờm nước cất cho ủủ 1 lớt mụi trường.
+ Mụi trường WA: Dựng 20g agar, ủun sụi trong 1 lớt nước cất.
+ Mụi trường cỏm agar: Cho 20g cỏm vào trong một lớt nước cất, ủun sụi trong 20 phỳt sau ủú lọc qua lớp vải màn ủụi, bỏ bó, Cho thờm vào dung dịch 5g
ủường ăn + 20g agar và bổ sung thờm nước cho ủủ 1 lớt mụi trường
Bước 3: Hấp khử trựng mụi trường
- ðổ mụi trường vào bỡnh tam giỏc (333ml/ 500ml), ủậy lại bằng giấy bạc rồi ủem hấp ở 121oC trong 20 phỳt.
Bước 4: ðổ mụi trường vào ủĩa Petri trong buồng cấy nấm ủó vụ trựng,
ủể nguội sau 1 ngày mới cấy nấm
3.4.3. Phương phỏp nghiờn cứu trong nhà lưới ủể xỏc ủịnh cỏc chủng sinh lý (Race) nấm Pyricularia oryzae (Race) nấm Pyricularia oryzae
- Chuẩn bị cõy chủ: Ngõm hạt giống của 12 giống chỉ thị cho nảy mầm,
ủem gieo vào cỏc khay nhụm cú bựn. Mỗi khay gieo 4 giống, mỗi giống hai hàng, mỗi hàng 10 hạt. Sau ủú ủặt cỏc khay vào bể và chăm súc cho cõy phỏt triển bỡnh thường. Sau khi gieo ủược 21 ngày (lỳc ủú lỳa cú 3 - 4 lỏ) thỡ phun dung dịch bào tửủể lõy bệnh.
- Chuẩn bị nguồn bào tửủể lõy bệnh: Nguồn nấm ủược lấy từống PSA nghiờng cấy vào ủĩa mụi trường cỏm agar, mỗi mẫu phõn lập cấy 2 ủĩa, mỗi
ủĩa cấy 3 ủiểm, sau ủú ủặt ủĩa ủó cấy vào tủ ủịnh ụn 26- 280C trong 2 tuần. Trong thời gian ủú sợi nấm sẽ mọc kớn mụi trường. Lấy ủĩa mụi trường ra khỏi tủ, dựng bỡnh tia phun nước cất khụng ion vào và dựng chổi lụng quột ủi quột lại nhiều lần trờn mặt ủĩa, rồi lại dựng bỡnh tia rửa hết sợi nấm, vẩy chổi cho hết nước, nghiờng ủĩa quột khụ mặt thạch (Mỗi mẫu phõn lập rửa bằng
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………44 một chổi, rửa xong luộc chổi trong nước sụi).
Cỏc ủĩa ủó rửa xong ủược ủặt trong tủ 12 giờ sỏng, 12 giờ tối, chỉ sau 3 ngày bào tửủó hỡnh thành. Dựng nước cất vụ trựng cú pha Tween 20 với nồng
ủộ 1/10.000 ủể rửa và lọc bào tử (20 ml nước ủể rửa bào tử cho một ủĩa petri). Lấy một dung dịch bào tửủó ủược lọc ở mỗi mẫu phõn lập nhỏ lờn lam và ủặt lờn soi dưới kớnh hiển vi. ðếm số bào tử trờn quang trường 10X, ủếm 3 quang trường. ðiều chỉnh dung dịch ủể cú khoảng 30 - 50 bào tử trờn một quang trường, tương ủương với 105 bào tử/ 1ml.
- Lõy nhiễm: Dựng bỡnh phun cầm tay loại cú thể tớch 0,5 l ủể phun dung dịch bào tử lờn cỏc khay lỳa. Phun ướt ủều khắp lỏ lỳa rồi ủặt cỏc khay
ủó ủược lõy nhiễm vào trong tủ lõy nhiễm. Phun mự giữ ẩm liờn tục trong vũng 24 giờ (ẩm ủộ > 90%). Sau khoảng thời gian ủú ủem lỳa ủó lõy nhiễm ra ngoài nhà lưới ủặt dưới ỏnh sỏng tỏn xạủồng thời tưới nước ủầy ủủ cho lỳa ủể
lỳa vẫn tiếp tục phỏt triển.
- ðỏnh giỏ: Sau 7 ngày lõy nhiễm tiến hành ủỏnh giỏ phản ứng của cỏc giống lỳa theo thang phõn cấp của Kato, 1993
Cấp 0: Khụng cú vết bệnh, khỏng cao (HR)
Cấp 1: Vết bệnh là chấm nhỏ bằng ủầu kim, khỏng (R)
Cấp 2: Vết bệnh to hơn màu nõu nhạt ủến nõu tối, khỏng (R)
Cấp 3: Vết bệnh to hơn cú màu xỏm ở giữa vết bệnh, nhiễm (S) Cấp 4: Vết bệnh ủiển hỡnh (hỡnh thoi màu xỏm ở giữa), nhiễm nặng (HS) Cấp 0, 1, 2: khỏng bệnh Cấp 3, 4: nhiễm bệnh
- Căn cứ vào cấp bệnh trờn cỏc giống chỉ thị ta biết ủược mức ủộ khỏng nhiễm trờn từng giống và xỏc ủịnh chủng sinh lý của nấm bệnh
3.4.4. Phương phỏp lập hàm hồi quy
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………45 huyện qua từng năm ủể lập phương trỡnh dự bỏo chỳng tụi ủó tiến hành như sau:
Từ cỏc số thụng bỏo sõu bệnh của cỏc trạm Bảo vệ thực vật huyện thu thập
ủược chỳng tụi tiến hành lọc bỏ cỏc số thụng bỏo cú ủộ tin cậy thấp sau ủú tớnh toỏn cỏc số liệu:
- Số liệu về cỏc yếu tố sinh thỏi (nhiệt ủộ, ủộ ẩm, lượng mưa, số giờ