III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ
3.4.3.Phương phỏp nghiờn cứu trong nhà lưới ủể xỏc ủị nh cỏc
(Race) nấm Pyricularia oryzae
- Chuẩn bị cõy chủ: Ngõm hạt giống của 12 giống chỉ thị cho nảy mầm,
ủem gieo vào cỏc khay nhụm cú bựn. Mỗi khay gieo 4 giống, mỗi giống hai hàng, mỗi hàng 10 hạt. Sau ủú ủặt cỏc khay vào bể và chăm súc cho cõy phỏt triển bỡnh thường. Sau khi gieo ủược 21 ngày (lỳc ủú lỳa cú 3 - 4 lỏ) thỡ phun dung dịch bào tửủể lõy bệnh.
- Chuẩn bị nguồn bào tửủể lõy bệnh: Nguồn nấm ủược lấy từống PSA nghiờng cấy vào ủĩa mụi trường cỏm agar, mỗi mẫu phõn lập cấy 2 ủĩa, mỗi
ủĩa cấy 3 ủiểm, sau ủú ủặt ủĩa ủó cấy vào tủ ủịnh ụn 26- 280C trong 2 tuần. Trong thời gian ủú sợi nấm sẽ mọc kớn mụi trường. Lấy ủĩa mụi trường ra khỏi tủ, dựng bỡnh tia phun nước cất khụng ion vào và dựng chổi lụng quột ủi quột lại nhiều lần trờn mặt ủĩa, rồi lại dựng bỡnh tia rửa hết sợi nấm, vẩy chổi cho hết nước, nghiờng ủĩa quột khụ mặt thạch (Mỗi mẫu phõn lập rửa bằng
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………44 một chổi, rửa xong luộc chổi trong nước sụi).
Cỏc ủĩa ủó rửa xong ủược ủặt trong tủ 12 giờ sỏng, 12 giờ tối, chỉ sau 3 ngày bào tửủó hỡnh thành. Dựng nước cất vụ trựng cú pha Tween 20 với nồng
ủộ 1/10.000 ủể rửa và lọc bào tử (20 ml nước ủể rửa bào tử cho một ủĩa petri). Lấy một dung dịch bào tửủó ủược lọc ở mỗi mẫu phõn lập nhỏ lờn lam và ủặt lờn soi dưới kớnh hiển vi. ðếm số bào tử trờn quang trường 10X, ủếm 3 quang trường. ðiều chỉnh dung dịch ủể cú khoảng 30 - 50 bào tử trờn một quang trường, tương ủương với 105 bào tử/ 1ml.
- Lõy nhiễm: Dựng bỡnh phun cầm tay loại cú thể tớch 0,5 l ủể phun dung dịch bào tử lờn cỏc khay lỳa. Phun ướt ủều khắp lỏ lỳa rồi ủặt cỏc khay
ủó ủược lõy nhiễm vào trong tủ lõy nhiễm. Phun mự giữ ẩm liờn tục trong vũng 24 giờ (ẩm ủộ > 90%). Sau khoảng thời gian ủú ủem lỳa ủó lõy nhiễm ra ngoài nhà lưới ủặt dưới ỏnh sỏng tỏn xạủồng thời tưới nước ủầy ủủ cho lỳa ủể
lỳa vẫn tiếp tục phỏt triển.
- ðỏnh giỏ: Sau 7 ngày lõy nhiễm tiến hành ủỏnh giỏ phản ứng của cỏc giống lỳa theo thang phõn cấp của Kato, 1993
Cấp 0: Khụng cú vết bệnh, khỏng cao (HR)
Cấp 1: Vết bệnh là chấm nhỏ bằng ủầu kim, khỏng (R)
Cấp 2: Vết bệnh to hơn màu nõu nhạt ủến nõu tối, khỏng (R)
Cấp 3: Vết bệnh to hơn cú màu xỏm ở giữa vết bệnh, nhiễm (S) Cấp 4: Vết bệnh ủiển hỡnh (hỡnh thoi màu xỏm ở giữa), nhiễm nặng (HS) Cấp 0, 1, 2: khỏng bệnh Cấp 3, 4: nhiễm bệnh
- Căn cứ vào cấp bệnh trờn cỏc giống chỉ thị ta biết ủược mức ủộ khỏng nhiễm trờn từng giống và xỏc ủịnh chủng sinh lý của nấm bệnh