III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ
3.4.2.Phương phỏp nghiờn cứu trong phũng
3.4.2.1. Phõn lập nấm theo phương phỏp cấy ủơn bào tử
- Mẫu bệnh khụ ủem rửa sạch, lau khụ sau ủú cắt một ủoạn cả phần mụ khoẻ và mụ bị bệnh ủặt trong ủĩa petri cú giấy lọc ẩm, ủậy nắp, ủểủĩa ở nhiệt
ủộ phũng khoảng 1 - 2 ngày ủể cho nấm bệnh mọc.
+ Lấy ủĩa WA (Water agar), cầm ỳp mặt thạch phớa dưới, gấp ủoạn lỏ hoặc cổ bụng cú vết bệnh, dựng panh cặp và ủặt cho bào tử ở vết bệnh dớnh vào bề mặt thạch, dựng bỳt dạ khoanh khu vực ủặt vết bệnh ủể khi ủưa lờn kớnh hiển vi dễ quan sỏt bào tử.
+ Khử trựng kim thuỷ tinh bằng cồn
+ ðưa ủĩa WA cú bào tử lờn kớnh hiển vi, quan sỏt và khờu bào tử vào
ủầu kim thuỷ tinh (ủiều chỉnh kớnh và kim thuỷ tinh chớnh xỏc sao cho mỗi lần khờu lấy một bào tử). Vặn vật kớnh lờn cao, ủưa ủĩa WA ra và cho ủĩa PSA vào theo chiều ỳp mặt thạch xuống phớa dưới, dựng bỳt dạ khoanh trũn 4- 5 khoanh của ủĩa, rồi từ từ thả bào tử từ ủầu kim thuỷ tinh vào nơi cú ủỏnh dấu khoanh trũn trờn ủĩa PSA. Mỗi khoanh trũn thả một bào tử (mỗi ủĩa PSA thả 4 bào tử)
+ ðậy nắp ủĩa lại và ủặt vào tủ ủịnh ụn. Sau 3- 4 ngày bào tử phỏt triển thành tản nấm, dựng que cấy nấm (ủó ủược vụ trựng) lấy một mẩu thạch cú sợi nấm non cấy vào ống nghiệm mụi trường PSA nghiờng ủể giữ nguồn ủể nghiờn cứu.
* Chuẩn bị mụi trường nghiờn cứu 3 loại mụi trường: WA, PSA và cỏm Agar.
Cỏch nấu mụi trường: Bước 1: Chuẩn bịủĩa petri
- Rửa sạch ủĩa bằng nước mỏy tiếp theo khử trựng khụ trong tủ sấy ở
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………43
Bước 2: Nấu mụi trường
+ Mụi trường PSA: Dựng 1kg khoai tõy gọt sạch vỏ, cắt thành từng lỏt mỏng + 1 lớt nước ủun sụi khoảng 30 phỳt sau ủú dựng lớp vải màn ủụi lọc thu
ủược nước khoai tõy (PB: Potato Broth). Lấy PB ủun sụi, cho vào ủú 20g ủường
ăn + 20g agar, ủổ thờm nước cất cho ủủ 1 lớt mụi trường.
+ Mụi trường WA: Dựng 20g agar, ủun sụi trong 1 lớt nước cất.
+ Mụi trường cỏm agar: Cho 20g cỏm vào trong một lớt nước cất, ủun sụi trong 20 phỳt sau ủú lọc qua lớp vải màn ủụi, bỏ bó, Cho thờm vào dung dịch 5g
ủường ăn + 20g agar và bổ sung thờm nước cho ủủ 1 lớt mụi trường
Bước 3: Hấp khử trựng mụi trường
- ðổ mụi trường vào bỡnh tam giỏc (333ml/ 500ml), ủậy lại bằng giấy bạc rồi ủem hấp ở 121oC trong 20 phỳt.
Bước 4: ðổ mụi trường vào ủĩa Petri trong buồng cấy nấm ủó vụ trựng,
ủể nguội sau 1 ngày mới cấy nấm