CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3.4. Phương pháp điện di miễn dịch đối lưu
Chuẩn bị thạch và mẫu
Tấm thủy tinh được rửa bằng xà phòng và tráng qua nước cất, lau lại bằng cồn acetone 50%. 1,5g agarose được hòa tan trong 100 ml dung dịch Barbital. Đun sôi nhẹ bằng lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Lọc dung dịch trên bằng miếng vải gạc tính lượng dùng vừa đủ. Dùng pipet đổ thạch lên các tấm thủy tinh (khoảng 14÷16ml/tấm kính). Để 30 phút cho thạch đông cứng. Sau khi thạch đã đông, dùng dụng cụ đục thạch thành hai dãy và số lượng giếng tùy theo mẫu kiểm tra, khoảng cách giữa các giếng khoảng 10mm.
Dung dịch ovalbumin cho vào dãy lô cột thứ nhất (10 µl/giếng). Dãy lô cột thứ 2 đối diện cho kháng nguyên ovalbumin (10 µl/giếng).
Chạy điện di
Đặt tiêu bản đã có kháng nguyên và kháng thể trên vào buồng điện di. Dãy có kháng nguyên nằm về phía cực âm, dãy có kháng huyết thanh nằm về phía cực dương. Dùng hai miếng giấy whatman thấm nối tiếp giữa bề mặt tiêu bản với dung dịch chạy điện di ở hai cạnh bên của tiêu bản. Đậy nắp buồng điện di, cắm phích điện, bật công tắc bên hông máy.
Điều chỉnh dòng điện chạy vào với hiệu điện thế là 150V (có thể từ 140÷170V) và cường độ dòng điện không vượt quá 90mA. Thời gian chạy điện di từ 30÷60 phút.
Rửa và nhuộm tiêu bản
Sau khi kết thúc chạy điện di tiêu bản được lấy ra và ngâm trong NaCl 0,85% từ 16÷24 giờ. Trong giai đoạn này, nên thay dung dịch 3 lần. Đây là giai đoạn rất quan trọng, nếu để ngâm lâu đường tủa sẽ biến mất. Rửa tiêu bản lại bằng nước cất và ngâm tiêu bản trong nước cất khoảng 30 phút. Đặt tiêu bản vào khay giữ ẩm. Sau đó, làm khô tiêu bản. Làm khô có thể có thể bằng hơi thổi < 30oC. Rửa lại tiêu bản bằng nước cất và đặt tiêu bản vào khay có chứa dung dịch nhuộm Coomasie 25% từ 5÷10 phút.
Đổ thuốc nhuộm đi và tẩy tiêu bản bằng dung dịch tẩy. Cứ như vậy nhuộm rửa ba lần. Để tiêu bản khô tự nhiên.