CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3.5.2. Các bước tiến hành
Gắn kháng thể kháng ovalbumin vào phiến ELISA
- Huyết thanh kháng ovalbumin tinh chế
- Pha loãng kháng thể trong đệm carbonate pH 9,6
- Cho 100 µl kháng thể đã pha loãng vào tất cả các giếng của phiến nhựa ELISA, ủ qua đêm ở 37oC.
- Rửa phiến 4 lần bằng dung dịch rửa 0,05% Tween 20 và khóa phiến bằng đệm casein 1%.
- Ủ ở 37oC, sau đó rửa 4 lần bằng dung dịch rửa.
Ủ với kháng nguyên ovalbumin
- Cho vào tất cả cả giếng 100 µl đệm pha kháng nguyên ovalbumin.
- Cho 100 µl ovalbumin chuẩn 20μg/ml và các mẫu thử ovalbumin vào các giếng ở hai cột đầu tiên.
- Tiến hành pha loãng bậc hai từ cột 2 đến cột thứ 11, cột 12 dùng làm chứng âm.
- Đậy phiến bằng băng keo, ủ 37oC trong một giờ.
Bắt phức hệ KT-KN bằng kháng thể đơn dòng kháng ovalbumin từ chuột
- Rửa phiến 4 lần bằng dung dịch rửa.
- Pha kháng thể đơn dòng kháng ovalbumin từ chuột thành nồng độ 1/5000 trong dung dịch đệm pha kháng thể.
- Cho vào tất cả các giếng 100 µl kháng thể đơn dòng đã pha loãng.
- Đậy phiến bằng băng keo và ủ 37oC/1 giờ.
Cho cộng hợp kháng chuột gắn biotin
- Rửa phiến 4 lần bằng dung dich rửa.
- Pha cộng hợp IgG kháng chuột gắn biotin thành nồng độ 1/2000 trong dung dịch đệm pha kháng thể.
- Cho vào tất cả các giếng 100 µl cộng hợp kháng chuột gắn biotin đã pha loãng.
- Đậy phiến bằng băng keo và ủ 37oC trong 1 giờ.
Cho Streptavidine-PO kết hợp biotin trên pha rắn
- Rửa phiến 4 lần bằng dung dịch rửa.
- Cho vào tất cả các giếng 100 µl dung dịch Streptavidin-PO pha loãng 1/5000 pha trong dung dich đệm pha kháng thể.
- Đậy phiến bằng băng keo và ủ 37oC trong 1 giờ.
Hiện màu và tính kết quả
- Rửa phiến 4 lần bằng dung dịch rửa.
- Cho vào tất cả các giếng 100 µl dung dịch cơ chất đã pha loãng trong đệm pha cơ chất.
- Sau 10÷15 phút phản ứng hiện màu. Dừng phản ứng bằng 50 µl H2SO4 2M/giếng.
Đo mật độ quang (OD) bằng máy đọc ELISA-Titertek Multiskal MCC/344 ở bước sóng 450nm. Tính kết quả bằng phần mềm Kinetic calculator V2.03 (Bio- Tek Instruments) và vẽ đồ thị (hình 2.3)