CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.4.2.Kết quả xác định độ nhạy của phản ứng
Có hai đại lượng đại diện cho độ nhạy của phản ứng là giới hạn phát hiện (Limit of Detection: LOD) và giới hạn định lượng (Limit of Quantitation: LOQ).
LOD là lượng thấp nhất của chất cần thử trong mẫu còn có thể phát hiện được mà không nhất thiết phải xác định chính xác hàm lượng. Thường việc xác định giới hạn phát hiện bằng cách tìm xem chất cần thử có nồng độ cao hơn hay thấp hơn một giới hạn nào đó. LOQ là lượng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử còn có thể xác định được với mức độ đúng và chính xác thích hợp. Giới hạn định lượng là một thông số của phương pháp định lượng đối với lượng thấp nhất của chất cần thử có trong khung mẫu và được sử dụng đặc biệt trong việc xác định các tạp chất và các sản phẩm phân hủy. Trong phản ứng ELISA có thể căn cứ trên mật độ quang của mẫu trắng (mật độ quang nền) tính được hai giá trị này theo công thức [10]:
LOD= OD nền trung bình + 3SD (độ lệch chuẩn) LOQ= OD nền trung bình + 10SD
Trong đó, SD (Standard deviation) là độ lệch chuẩn của phản ứng. Độ lệch chuẩn của phản ứng càng thấp thì LOD, LOQ càng có độ chính xác cao hay độ chính xác của phản ứng càng cao.
Cách xác định: với cùng một mẫu đã được làm đồng nhất, tiến hành xác định bằng phương pháp đề xuất nhiều lần n lần (n= 6÷10 hay nhiều hơn…), sau đó áp dụng công thức: SD = ( ) 1 2 − − ∑ n X Xi
Trong đó: xi là giá trị đo được thứ i X là giá trị trung bình n là số lần đo
Xác định độ nhạy của phương pháp là tìm nồng độ ovalbumin thấp nhất có trong mẫu thử còn có thể phát hiện được và xác định chính xác nồng độ ovalbumin có trong mẫu thử, sau khi tiến hành pha loãng ovalbumin thành nhiều độ pha khác nhau.
Bảng 3.4. Độ nhạy của phản ứng (LOD và LOQ)
n OD nền trung bình SD Độ nhạy LOD LOQ OD Nồng độ ovalbumin (ng/ml) OD Nồng độ ovalbumin (ng/ml) 24 0,078 0,014 0,102 30 0,173 60
Từ bảng 3.4 ta thấy, LOD của phản ứng có mật độ quang là 0,102 và LOQ có mật độ quang là 0,173 tương ứng với nồng độ ovalbumin lần lượt là 30ng/ml và 60ng/ml. Như vậy, đối với mẫu thử có nồng độ ovalbumin ≥ 30ng/ml thì phương pháp ELISA phát hiện được với mức độ định tính. Ở nồng độ ovalbumin ≥ 60ng/ml có trong mẫu thử sẽ được xác định ở mức độ định lượng trong phương pháp này. Kết quả này cho thấy, hệ ELISA được xây dựng trong nghiên cứu này có khả năng phát hiện ovalbumin với khoảng nồng độ tương đương với bộ kít ELISA định lượng ovalbumin của hãng Alpha Diagnostic International (1ng đến 20ng).
Bên cạnh đó, tiêu chuẩn của hàm lượng ovalbumin trong vacxin cúm cho phép là nhỏ hơn 1 µg/ml. Trong khi đó, phương pháp này có thể định lượng được 60ng/ml nhỏ hơn 16 lần so với mức yêu cầu. Chính vì thế, phương pháp này có thể định lượng với các mẫu có hàm lượng ovalbumin thấp và cho độ chính xác cao. Do đó, phương
pháp này đạt yêu cầu trong phát hiện và định lượng ovalbumin trong vacxin cúm A/H5N1.
Như vậy, hệ ELISA xây dựng theo phương pháp này đạt tiêu chuẩn xác định nồng độ ovalbumin trong vacxin cúm A/H5N1 theo mục tiêu đã đề ra.