CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2.TINH CHẾ KHÁNG THỂ THỎ (IgG) KHÁNG OVALBUMIN
Huyết thanh thỏ thô kháng ovalbumin được tinh chế bằng cột tinh chế IgG HiTrap protein G HP của Amersham Biociences. Kết quả tinh chế được thể hiện quả kết quả đo mật độ quang (OD) huyết thanh sau tinh chế và kết quả chạy điện di SDS- PAGE.
• Kết quả đo mật độ quang
Mật độ quang bước sóng 280nm được dùng để xác định hàm lượng protein tổng số có trong mẫu huyết thanh tinh chế.
Kết quả biểu thị ở đồ thị 3.2.
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn các phân đoạn thu được khi tinh chế huyết thanh kháng ovalbumin.
Từ hình 3.2 cho thấy phân đoạn 3, 4, 5 cho kết qủa OD cao. Các phân đoạn còn lại có độ OD thấp.
Hàm lượng kháng thể (IgG)=1OD,35 (mg/ml). Kết quả này được tổng hợp bởi bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả kháng thể sau khi tinh chế
Phân đoạn OD Nồng độ IgG
(mg/ml) Hàm lượng IgG (mg) 1 0,034 0,025 0,063 2 0,297 0,221 0,554 3 3,000 4,444 11,110 4 2,750 2,037 5,092 5 2,590 1,918 4,795 6 1,014 0,751 1,877 7 - - - 8 - - - 9 - - - 10 - - -
Theo bảng trên ta thấy IgG được tập trung trong các phân đoạn 3, 4, 5 với nồng độ IgG lần lượt là: 4,444mg/ml; 2,037mg/ml; 1,198mg/ml dung dịch đệm hồi giải. Trong đó, tập trung nhiều nhất là ở phân đoạn 3 với hàm lượng IgG thu được là 11,11mg. Tổng lượng IgG thu được là 23,671mg. Như vậy, với 4ml huyết thanh thô, nồng độ IgG thu được là 5,378mg/ml. Cho thấy, hàm lượng kháng thể sau khi tinh chế là đạt yêu cầu. Do đó, chúng tôi đã chọn các phân đoạn 3, 4, 5 làm mẫu cho các thử nghiệm tiếp theo.
Bên cạnh đó, cùng với việc đo OD của các phân đoạn huyết thanh sau tinh chế, tiến hành đo OD của dung dịch sau khi rửa các protein thừa sau khi qua cột thu được kết quả: OD = 0,004. Như vậy, hàm lượng protein trong mẫu này còn rất thấp chứng tỏ quá trình rửa đã đảm bảo loại hết các protein thừa không liên kết với protein G.
• Kết quả chạy điện di SDS-PAGE
Kết quả tinh chế còn thể hiện ở độ tinh sạch của huyết thanh sau tinh chế. Độ tinh sạch của các mẫu huyết thanh sau tinh chế sau khi kiểm tra lại bằng phương pháp điện di SDS-PAGE.
Hình 3.3. Tiêu bản nhuộm Coomassie bản điện di SDS-PAGE (10% SDS) các mẫu huyết thanh.
1, 10: thang protein, 2: HT thô, 3: dịch thu được sau khi qua cột, 4, 5, 6, 7, 8, 9: phân đoạn 3, 4, 5, 6, 7, 8.
Hình 3.2 cho thấy, ở các mẫu 4, 5, 6 (tương ứng với phân đoạn 3, 4, 5) có hàm lượng IgG nhiều hơn các mẫu khác. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả cho ở bảng 3.3. Ở mẫu huyết thanh thô, albumin có hàm lượng rất lớn, nhưng sau khi tinh chế, ở các phân đoạn 3, 4, 5, 6, 7, 8 thì thành phần này hầu như không có. Như vậy, huyết thanh tinh chế có độ sạch cao đặc biệt là thành phần albumin được loại bỏ gần như hoàn toàn.
Như vậy, quá trình tinh chế kháng thể kháng ovalbumin đã thành công với hàm lượng kháng thể thu được là 5,873mg/ml huyết thanh thô. Tập trung chủ yếu ở các phân đoạn 3, 4, 5 nhiều nhất là phân đoạn 3 với 11,110 mg. Huyết thanh tinh chế cũng đảm bảo độ sạch khi chạy điện di SDS-PAGE.