- Phân lập vi khuẩn Pseudomonas spp gây bệnh lở loét trên cá Bống
2.4.1.3.Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu phân lập vi khuẩn.
* Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
Sau khi thu được dịch từ mẫu gan và thận cá bệnh thì tiến hành nuôi cấy vi khuẩn. Dùng que cấy hơ nóng trước ngọn lửa đèn cồn để vô trùng, để nguội. Lấy dịch từ mẫu bệnh phẩm và cấy vi khuẩn vào đĩa petri với môi trường Nutrient Agar (NA). Phương pháp thường dùng là cấy ria, mục đích làm cho khuẩn lạc đứng riêng rẽ.
Hình 2.2. Đường cấy vi khuẩn trên đĩa lồng
(1 1 ) ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) Thu mẫu bệnh phẩm (gan, thận)
Nuôi cấy, phân lập
Nhuộm gram Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc Thử phản ứng sinh hoá Phân lập vi khuẩn Mẫu cá bệnh
Sau khi cấy xong thì đưa môi trường đã cấy vi khuẩn và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 290C. Sau thời gian 24 – 48h nuôi cấy trong tủ ấm thì vi khuẩn có thể phát triển tốt. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng để nuôi cấy tăng sinh nhằm tăng lượng vi khuẩn lên.
* Phương pháp phân lập vi khuẩn
Sau khi được giống vi khuẩn thuần, tiến hành nhuộm Gram để phân lập vi khuẩn. Phương pháp nhuộm Gram được thực hiện như sau:
- Lấy mẫu phết lên lam, cho thêm 1 đến 2 giọt nước muối sinh lý vô trùng, dùng đầu que cấy dàn mỏng lên lam kính.
- Để mẫu tự khô ở nhiệt độ phòng
- Hơ cao lam kính có mẫu trên ngọn lửa đèn cồn, để cố định và diệt vi khuẩn - Nhỏ tiếp dung dịch 1: thuốc tím Violet lên tiêu bản, để yên 30-60 giây
à Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 2 (Lugol) để cố định trong 1 phút à Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 3 (Cồn Aceton) để nghiêng đầu một bên lam để cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn, nhằm tẩy màu à Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 4 (Safranin) để cố định 1 đến 2 phút à Rửa nước, để khô hoặc dùng giấy thấm khô, không được để xước mẫu.
- Soi dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu (độ phóng đại x1000). Dưới kính hiển vi ta có thể xác định được các nhóm vi khuẩn nhờ khả năng bắt màu của chúng: vi khuẩn gram âm (bắt màu hồng) và vi khuẩn gram dương (bắt màu xanh tím).
* Phương pháp định danh vi khuẩn
Theo Bergey 1994 và được bổ sung bởi Buller 2004. Kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn để định danh:
- Thử phản ứng sinh Indol được thực hiện với kết quả dương tính (nếu bắt màu hồng của thuốc nhuộm) hoặc âm tính (không màu).
- Thử phản ứng với H2S. - Thử phản ứng với lactose.
- Thử khả năng di động của vi khuẩn: được thử trên môi trường NA (Nutrient Agar). Lấy các khuẩn lạc riêng rẽ để thực hiện thử khả năng di động, chuẩn bị môi trường trong các ống nghiệm và tiến hành cấy đâm sâu vào môi trường. Tiến hành nuôi trong tủ ấm 30 – 370C và trong thời gian 24 – 36 h, vi khuẩn có khả năng di động sẽ mọc đâm ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh.