2.3.1 DNA ty thể
DNA ty thể là DNA tồn tại trong ty thể. DNA ty thể được phát hiện bằng kính hiển vi điện tử (Nass &ctv, 1963) và được phát hiện bằng phương pháp sinh hóa (Ellen &ctv, 1964).
DNA ty thể có dạng vòng. DNA ty thể và DNA nhân được cho là tách biệt trong nguồn gốc tiến hóa, với DNA ty thể có nguồn gốc từ genome dạng vòng của vi khuẩn cộng sinh với tổ tiên của tế bào eukaryote ngày nay (thuyết cộng sinh tế bào). Mỗi ty thể chứa khoảng 2-10 bản sao mtDNA (Wiesner & ctv, 1992). Trong các sinh vật hiện có, đa số các protein hiện diện trong ty thể (khoảng 1500 loại khác nhau ở hữu nhũ) được mã hóa bởi DNA nhân, nhưng những gen này được cho là có nguồn gốc từ vi khuẩn, đã được chuyển vào nhân tế bào eukaryote trong suốt quá trình tiến hóa.. Mặc dù mtDNA được đóng gói bởi các protein và có khả năng sửa chữa DNA, nhưng những chức năng bảo vệ này ít hơn DNA nhân. Vì thế mtDNA dễ ảnh hưởng lên sự hư hại do oxi hóa. Đột biến ở mtDNA là nguyên nhân các bệnh di truyền từ mẹ và các bệnh liên quan đến tuổi.
Ở người và ở các động vật đa bào nói chung có khoảng 100-10.000 bản sao của mtDNA trong một tế bào (trừ trứng và tinh trùng) (Bogenhagen & Clayton, 1974). Ở động vật hữu nhũ, mỗi phân tử mtDNA gồm 15.000 – 17.000 bp, mã hóa cho 37 gen: 13 gen cho những protein trong chuỗi vận chuyển (polypeptides), 22 cho transfer RNA (tRNA), và 1 trong 2 gen còn lại mỗi gen mã hóa cho một đơn vị lớn và một đơn vị nhỏ của RNA ribosome (rRNA).
¾ 13 gen mã hóa protein trong chuỗi vận chuyển (Transport chain)
Được trình bày ở bảng 2.2
Bảng 2.2: 13 gen mã hóa protein trong chuỗi vận chuyển
Loại protein Gen
NADH dehydrogenase (complex I)
MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3, MT-ND4, MT- ND4L, MT-ND5, MT-ND6
Coenzyme Q - cytochrome c reductase/Cytochrome b (complex III)
MT-CYB
cytochrome c oxidase
(complex IV) MT-CO1, MT-CO2, MT-CO3
ATP synthase MT-ATP6, MT-ATP8
¾ 2 gen mã hóa rRNA: MT-RNR1 (12S) và MT-RNR2 (16S)
¾ 22 gen mã hóa tRNA
Bảng 2.3: 22 gen mã hóa tRNA
Amino Acid 3 mẫu tự 1 mẫu tự mtDNA
Alanine Ala A MT-TA
Arginine Arg R MT-TR
Asparagine Asn N MT-TN
Aspartic acid Asp D MT-TD
Cysteine Cys C MT-TC
Glutamic acid Glu E MT-TE
Glutamine Gln Q MT-TQ
Glycine Gly G MT-TG
Histidine His H MT-TH
Isoleucine Ile I MT-TI
Leucine Leu L MT-TL1, MT-TL2 Lysine Lys K MT-TK Methionine Met M MT-TM Phenylalanine Phe F MT-TF Proline Pro P MT-TP Serine Ser S MT-TS1, MT-TS2 Threonine Thr T MT-TT Tryptophan Trp W MT-TW
Tyrosine Tyr Y MT-TY
Hình 2.2: Genome của ty thể
2.3.2 Di truyền của ty thể
Ở hầu hết các sinh vật đa bào, mtDNA được thừa hưởng từ mẹ (Gyllesten và ctv, 1991). Cơ chế của điều này là do:
Sự pha loãng đơn giản (một trứng chứa 100.000 đến 1.000.000 phân tử mtDNA, trong khi đó một tinh trùng chỉ chứa 100 đến 1000 mtDNA).
Sự giảm mtDNA của tinh trùng trong quá trình thụ tinh với trứng. Tinh trùng có thể mang một ít ty thể ở phía đuôi như là một nguồn năng lượng để cho tinh trùng hoạt động trên hành trình dài tìm đến với trứng. Khi một tinh trùng nào đó may mắn gắn được với trứng trong quá trình thụ tinh thì đuôi của nó cũng rụng đi. Hệ quả là cơ thể mới được tạo thành chỉ chứa ty thể của mẹ truyền cho. Năm 1999, Sutovsky và ctv đã làm thí nghiệm trong đó ty thể tinh trùng (có mtDNA) được gắn ubiquytin và nhận thấy chúng bị phá hủy ở phôi (Sutovsky, 1999).
Sự thiếu sót của mtDNA tinh trùng để vào trứng ở một số ít sinh vật.
Mặc dù có một vài bằng chứng gần đây cho thấy rằng trong một số trường hợp hiếm, bào quan này cũng được di truyền từ bố. Người ta cho rằng ty thể có thể đôi khi được di truyền từ bố ở một vài loài như loài trai (Hoeh & ctv, 1991; Zouros & ctv, 1992; Penman & Danny, 2002). Ty thể được di truyền từ bố cũng được tìm thấy ở một vài loài côn trùng như ruồi (Kondo & ctv, 1992), ong (Meusel & Moritz, 1993), và loài ve (Fontaine & ctv, 2007).
Di truyền của ty thể từ bố có thể gặp trong các trường hợp sau: phôi được dòng hóa, sự loại bỏ ty thể từ bố xảy ra sau, trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Như vậy không giống với DNA của nhân tế bào, vật chất di truyền của ty thể không có hiện tượng trộn lẫn qua mỗi thế hệ do đó nó thay đổi với tốc độ chậm hơn. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu quá trình tiến hóa của con người.
http://www.thuvienkhoahoc.com/).
2.3.3 Sử dụng gen cytochrome b để phát hiện nguồn gốc loài trong các sản phẩm thịt chế biến thịt chế biến
Ngày nay, mtDNA thường được sử dụng để phát hiện loài trong các sản phẩm thịt chế biến (Hsing & ctv, 2005; Kesmen & ctv, 2007). DNA ty thể có số lượng bản sao cao hơn so với DNA nhân trong một tế bào (100-10.000 bản sao của mt DNA so với 1 của DNA nhân). Trong khi đó, thịt chế biến thường có DNA bị biến tính. Nên
việc khuếch đại mtDNA là dễ dàng hơn.
Trong các gen của ty thể, gen cytochrome b thường được sử dụng trong việc phát hiện loài (Kocher & ctv, 1989; Irwin & ctv, 1991; Matsunaga & ctv, 1999; Hsieh & ctv, 2001; Bellagamba & ctv, 2003; Pascoal & ctv, 2005; Maede, 2006). Nhưng không phải sử dụng hết hoàn toàn trình tự gen cytochrome b mà chỉ sử dụng một phần. Lý do là kích thước của gen này lớn (khoảng 1140 bp).
Để thuận tiện trong việc nghiên cứu, DNA ty thể thường được ly trích từ cơ. Vì ty thể thực hiện chức năng hô hấp giải phóng năng lượng cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào, tạo ra một số sản phẩm trung gian cần thiết. Do nhu cầu năng lượng là khác nhau đối với các tế bào trong cơ thể và cũng như các loại tế bào nên số lượng ty thể trong tế bào cũng khác nhau và sự sắp xếp ty thể trong tế bào cũng phụ thuộc rất nhiều vào chức năng sinh lý cũng như điều kiện môi trường. Vì thế, ở các tế bào như là cơ, gan... thì hoạt động cần thiết phải có một lượng lớn năng lượng sinh học tế bào.
2.4 Tổng quan các công trình nghiên cứu về phát hiện loài của thịt bằng phương pháp multiplex PCR pháp multiplex PCR
Phương pháp PCR nói chung và phương pháp multiplex PCR nói riêng đã được sử dụng rộng rãi để phát hiện hay phân biệt DNA của các sinh vật khác nhau từ nhiều nguồn mẫu. Vì thế, multiplex PCR được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng trong việc phân biệt loài động vật ở các sản phẩm thịt chế biến.
Năm 1997, Wayne và ctv đã có công trình nghiên cứu về trình tự DNA ty thể dài 2001bp của 23 dòng chó. Kết quả nghiên cứu cho thấy trên DNA ty thể có trình tự bảo toàn cho cả 23 dòng chó.
Tại Hoa Kỳ, Sawyer (1997) đã tìm ra một phương pháp nhanh và nhạy để xác định và ngăn chặn tình trạng nhập khẩu bò nhiễm BSE. Tác giả đã xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt bò trong thịt và bột xương thịt dựa trên đoạn gen bảo toàn của DNA ty thể bò.
Năm 1999, Matsunaga và ctv đã công bố công trình nghiên cứu phát hiện 6 loại thịt (bò, heo, cừu, dê, ngựa, gà) từ thịt chế biến. Tác giả sử dụng 7 đoạn primer với tỉ lệ thích hợp để phát hiện DNA chuyên biệt cho từng loài. Primer xuôi được thiết kế dựa trên trình tự DNA bảo toàn của DNA ty thể, còn primer ngược được thiết kế dựa
vào trình tự chuyên biệt ở mỗi loài. Các cặp primer này cho ra các sản phẩm PCR có kích thước khác nhau tương ứng với 6 loại thịt. Các đoạn DNA của dê, gà, bò, cừu, heo, ngựa lần lượt có kích thước: 157bp, 227bp, 274bp, 331bp, 398bp, 439bp. Kết quả PCR được quan sát bằng điện di. DNA của dê, bò, cừu, heo, được phát hiện cả đối với DNA tách chiết từ thịt xử lý nhiệt ở 100oC hay 120oC, riêng đối với thịt ngựa thì không phát hiện được ở 120oC. Giới hạn thấp nhất của nồng độ DNA mà phản ứng PCR còn phát hiện được là 0,25 ng.
Năm 2000, Montiel-Sosa và ctv thiết kế cặp primer có tính chuyên biệt cao trên đoạn bảo toàn của gen DNA ty thể. Cặp primer này được dùng để khuếch đại đoạn DNA dài 531bp của gia cầm bằng phương pháp PCR. Phương pháp này tỏ ra hữu dụng cả thịt tươi và hỗn hợp thịt chế biến bao gồm thịt phơi khô và thịt nấu chín từ bò, cừu, gà.
Một phương pháp để phát hiện những trình tự DNA ty thể của thịt bò, thịt cừu, thịt heo, thịt gà dựa vào PCR đã được phát triển. Phương pháp cho phép phát hiện trong hỗn hợp có 0,01% loài mục tiêu (Kremar & Rencova, 2003).
Dalmasso & ctv (2004) đã sử dụng phương pháp multiplex PCR để phát hiện nguồn gốc loài của thịt làm nguyên liệu trong sản xuất thức ăn gia súc (thú nhai lại, gia cầm, cá, heo). Primer được thiết kế dựa vào các vùng khác nhau của DNA ty thể (12S rRNA, tRNA và 16S rRNA) sau khi sắp gióng cột với các trình tự có sẵn trên ngân hàng gen. Giới hạn phát hiện là 0,004% cho primer cá, 0,002% cho primer thú nhai lại, gia cầm và heo.
Năm 2004, Miguel và ctv đã sử dụng phương pháp PCR để phát hiện thịt heo, bò, cừu, dê trong thịt tươi và thịt chế biến. Primer forward chung được thiết kế dựa vào trình tự DNA bảo tồn trên gene RNA ribosome 12S ty thể, reverse primer được thiết kế dựa vào trình DNA chuyên biệt mỗi loài. Kích thước khác nhau của các sản phẩm khuếch đại chuyên biệt ở mỗi loài được phân tách bằng phương pháp điện di. Giới hạn phát hiện của phương pháp này là 1% cho mỗi loài. Phương pháp này có thể xác định chính xác những loài heo, bò, cừu, dê; có ích trong việc kiểm tra các sản phẩm thịt hỗn hợp, tránh tình trạng giả mạo hoặc không đúng như đã ghi trên nhãn.
Việc xác định nhanh thịt bò có trong thực phẩm là cần thiết để kiểm soát hiệu quả mầm bệnh bò điên. Năm 2004, Hong và ctv đã sử dụng phương pháp multiplex PCR để phát hiện trình tự DNA chuyên biệt của thịt bò trong thực phẩm. Đồng thời tác
giả cũng sử dụng phương pháp multiplex PCR để đánh giá chất lượng của mẫu kiểm nghiệm nhờ vào việc khuếch đại vùng DNA trên gene ribosome 18 S chuyên biệt ở bò. Sản phẩm khuếch đại là đoạn DNA của lactoferrin. Tác giả dựa vào sự khác nhau ở trình tự ty thể chuyên biệt để xác định thịt bò. Độ đặc hiệu của phương pháp này được xác nhận dựa vào sự vắng mặt của sản phẩm PCR tương đồng có thể phát hiện sử dụng những mẫu thực phẩm liên quan mà không có thịt và bột xương bò, hoặc những mẫu DNA từ động vật có xương sống mà những thứ bỏ đi của chúng thường có trong thức ăn chăn nuôi. Phương pháp này có thể phát hiện sự hiện diện của thịt bò trong thực phẩm khi những mẫu thực phẩm này chứa > 0,02 % thịt và bột xương bò. Hơn nữa, phương pháp này ít ảnh hưởng bởi việc xử lý nhiệt kéo dài. Độ đặc hiệu, thuận tiện và nhạy của phương pháp này cho thấy rằng nó có thể được sử dụng để phát hiện thịt bò.
Arslan & ctv (2006) đã nghiên cứu ảnh hưởng của cách chế biến thịt đối với việc phát hiện thịt bò đã qua xử lý nhiệt bằng kỹ thuật PCR. Nhóm tác giả đã xử lý thịt bằng cách luộc ở 97,5oC trong 140 phút, 200 phút, 230 phút; quay ở 200oC trong 80 phút, 120 phút, 150 phút hoặc hấp khử trùng ở 120oC trong 30 phút, 60 phút, 90 phút; rán ở 115oC trong 45 phút, sau đó rán thêm cho đến khi không còn mùi thơm của thịt. Sản phẩm khuếch đại là 271 bp của DNA ty thể. Kết quả cho thấy rằng ngoại trừ mẫu thịt bò rán ở 80 phút, thịt bò được phát hiện trong tất cả các mẫu còn lại.
Năm 2007, Jain và ctv cũng sử dụng phương pháp multiplex PCR để phân biệt 7 loại thịt heo, gà, bò, trâu, dê, cừu, ngựa. Tác giả sử dụng forward primer và reverse primer cho heo, gà, trâu, bò, dê, cừu, ngựa giống như Matsunaga và ctv, 1999. Tác giả sử dụng reverse primer cho trâu là reverse primer của bò. Kết quả sản phẩm khuếch đại của dê, gà, bò, trâu, cừu, heo và ngựa lần lượt là 157 bp, 227bp, 274bp, 274bp, 331bp, 398bp, và 439bp. Như vậy, bò và trâu có sản phẩm PCR cùng kích thước. Nên tác giả khuyến cáo rằng cần phải thiết kế một reverse primer riêng cho trâu.
Trịnh Thị Thanh Huyền và ctv (2007) cũng đã sử dụng phương pháp multiplex – PCR để phân biệt thịt cừu, heo, bò. Nghiên cứu đã xác định được quy trình thích hợp, trong đó lượng FSIM: RP: RBC: RS lần lượt là 12: 25: 7: 5 pmol, nhiệt độ và thời gian của chu kỳ nhiệt ở giai đoạn lặp lại là: biến tính ở 94oC/1 phút, bắt cặp ở 54oC/ 45 giây, kéo dài ở 72oC/ 1phút. Nồng độ thấp nhất của thịt cừu, bò mà phản ứng multiplex-PCR có thể phát hiện là 1 ng/μl.
Chương 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành
Đề tài được thực hiện từ 10/2009 đến 5/2010
Việc ly trích DNA và thực hiện PCR được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ môi trường – Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3.2 Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Xây dựng quy trình m-PCR phân biệt thịt dê, cừu, heo, gà, bò lẫn trâu 3.2.2 Ứng dụng quy trình m-PCR
Khảo sát m-PCR trong việc phát hiện 6 loại thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong hỗn hợp DNA từ thịt tươi, thịt chế biến và bột thịt.
3.3 Vật liệu
3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA
Hai nhóm mẫu được dùng trong đề tài này là:
- Mẫu cơ vân các loại thịt heo, gà, bò, dê, cừu được lấy tại lò mổ ở Củ Chi, TP HCM
- Mẫu bột xương thịt sử dụng trong chế biến thức ăn gia súc của các hãng sản xuất thức ăn gia súc.
3.3.2 Primer
3.3.2.1 Primer dùng trong kỹ thuật m-PCR để phân biệt thịt dê, cừu, heo, gà, bò và/hoặc trâu
- Forward primer:
Một forward primer được dùng cho phản ứng m-PCR, thiết kế dựa vào vùng bảo tồn trên DNA ty thể của các loài heo, gà, dê, cừu, bò (Matsunaga và ctv, 1999); ký hiệu FSIM.
FSIM: 5’ – GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA – 3’
- Các reverse primer:
Các reverse primer được thiết kế cho từng loài gia súc dê, gà, cừu, heo, bò dựa trên trình tự không bảo tồn của DNA ty thể, được ký hiệu là RG (dê), RCh (gà), RS (cừu), RP (heo), RCB (bò) có trình tự như sau (Matsunaga và ctv, 1999):
¾ RG: 5’ – CTCGACAAATGTGAGTTACAGAGGGA – 3’
¾ RCh: 5’ – AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG – 3’
¾ RS: 5’ – CTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGCA – 3’
¾ RP: 5’ – GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA – 3’
¾ RCB: 5’ – CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG – 3’
Cặp primer FSIM & RCB của Matsunaga và ctv (1999) cũng được sử dụng để phát hiện thịt trâu (Jain và ctv 2007)
3.3.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
Hóa chất tách chiết DNA: Tris HCl, NaCl, SDS, EDTA, protein K, sodium acetate,
isoamyl alcohol, phenol, chloroform, ethanol, TE 1X.
Hóa chất của phản ứng PCR: Taq DNA polymerase 5UI/μl (Promega), dung dịch đệm 10X (Promega), dNTP 25mM (Promega), MgCl2 25 mM (Promega), các primer (IDT), nước cất 2 lần (khử ion, hấp vô trùng, chiếu UV, pH 6,8 – 7).
Hóa chất điện di: Agarose, TBE 0,5 X (Tris borate EDTA, pH 8,3), loading dye 6X,
ladder 100bp, 200bp, ethidium bromide.
Thiết bị và dụng cụ: Tủ sấy (Jencons – PLS), water bath (Memmert), autoclave (Tommy), máy cất nước (khử ion) (Branstead), máy ly tâm (Mikro Z2K/Sigma 3K30C), tủ trữ mẫu và hóa chất (Reetech, Brandt, Sanyo), máy nghiền mẫu (Model A11, IKA-Đức), máy chụp gel (Biorad), máy luân nhiệt, bộ điện di (Biorad), máy đo OD (Hewlett Packard), micropipet, đầu tip, eppendorf, kéo, chày, kẹp...
3.4 Phương pháp tiến hành 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu
Mỗi loại thịt được lấy khoảng 500g cho vào từng túi nilon sạch kích thước 5 x 10 cm, dán nhãn cho mỗi loại thịt, trữ trong thùng đá, đem về phòng thí nghiệm, trữ ở -700C.
Mẫu bột xương thịt được lấy khoảng 6 mẫu (100g/mẫu) từ các công ty chế biến thức ăn gia súc.