pháp multiplex PCR
Phương pháp PCR nói chung và phương pháp multiplex PCR nói riêng đã được sử dụng rộng rãi để phát hiện hay phân biệt DNA của các sinh vật khác nhau từ nhiều nguồn mẫu. Vì thế, multiplex PCR được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng trong việc phân biệt loài động vật ở các sản phẩm thịt chế biến.
Năm 1997, Wayne và ctv đã có công trình nghiên cứu về trình tự DNA ty thể dài 2001bp của 23 dòng chó. Kết quả nghiên cứu cho thấy trên DNA ty thể có trình tự bảo toàn cho cả 23 dòng chó.
Tại Hoa Kỳ, Sawyer (1997) đã tìm ra một phương pháp nhanh và nhạy để xác định và ngăn chặn tình trạng nhập khẩu bò nhiễm BSE. Tác giả đã xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt bò trong thịt và bột xương thịt dựa trên đoạn gen bảo toàn của DNA ty thể bò.
Năm 1999, Matsunaga và ctv đã công bố công trình nghiên cứu phát hiện 6 loại thịt (bò, heo, cừu, dê, ngựa, gà) từ thịt chế biến. Tác giả sử dụng 7 đoạn primer với tỉ lệ thích hợp để phát hiện DNA chuyên biệt cho từng loài. Primer xuôi được thiết kế dựa trên trình tự DNA bảo toàn của DNA ty thể, còn primer ngược được thiết kế dựa
vào trình tự chuyên biệt ở mỗi loài. Các cặp primer này cho ra các sản phẩm PCR có kích thước khác nhau tương ứng với 6 loại thịt. Các đoạn DNA của dê, gà, bò, cừu, heo, ngựa lần lượt có kích thước: 157bp, 227bp, 274bp, 331bp, 398bp, 439bp. Kết quả PCR được quan sát bằng điện di. DNA của dê, bò, cừu, heo, được phát hiện cả đối với DNA tách chiết từ thịt xử lý nhiệt ở 100oC hay 120oC, riêng đối với thịt ngựa thì không phát hiện được ở 120oC. Giới hạn thấp nhất của nồng độ DNA mà phản ứng PCR còn phát hiện được là 0,25 ng.
Năm 2000, Montiel-Sosa và ctv thiết kế cặp primer có tính chuyên biệt cao trên đoạn bảo toàn của gen DNA ty thể. Cặp primer này được dùng để khuếch đại đoạn DNA dài 531bp của gia cầm bằng phương pháp PCR. Phương pháp này tỏ ra hữu dụng cả thịt tươi và hỗn hợp thịt chế biến bao gồm thịt phơi khô và thịt nấu chín từ bò, cừu, gà.
Một phương pháp để phát hiện những trình tự DNA ty thể của thịt bò, thịt cừu, thịt heo, thịt gà dựa vào PCR đã được phát triển. Phương pháp cho phép phát hiện trong hỗn hợp có 0,01% loài mục tiêu (Kremar & Rencova, 2003).
Dalmasso & ctv (2004) đã sử dụng phương pháp multiplex PCR để phát hiện nguồn gốc loài của thịt làm nguyên liệu trong sản xuất thức ăn gia súc (thú nhai lại, gia cầm, cá, heo). Primer được thiết kế dựa vào các vùng khác nhau của DNA ty thể (12S rRNA, tRNA và 16S rRNA) sau khi sắp gióng cột với các trình tự có sẵn trên ngân hàng gen. Giới hạn phát hiện là 0,004% cho primer cá, 0,002% cho primer thú nhai lại, gia cầm và heo.
Năm 2004, Miguel và ctv đã sử dụng phương pháp PCR để phát hiện thịt heo, bò, cừu, dê trong thịt tươi và thịt chế biến. Primer forward chung được thiết kế dựa vào trình tự DNA bảo tồn trên gene RNA ribosome 12S ty thể, reverse primer được thiết kế dựa vào trình DNA chuyên biệt mỗi loài. Kích thước khác nhau của các sản phẩm khuếch đại chuyên biệt ở mỗi loài được phân tách bằng phương pháp điện di. Giới hạn phát hiện của phương pháp này là 1% cho mỗi loài. Phương pháp này có thể xác định chính xác những loài heo, bò, cừu, dê; có ích trong việc kiểm tra các sản phẩm thịt hỗn hợp, tránh tình trạng giả mạo hoặc không đúng như đã ghi trên nhãn.
Việc xác định nhanh thịt bò có trong thực phẩm là cần thiết để kiểm soát hiệu quả mầm bệnh bò điên. Năm 2004, Hong và ctv đã sử dụng phương pháp multiplex PCR để phát hiện trình tự DNA chuyên biệt của thịt bò trong thực phẩm. Đồng thời tác
giả cũng sử dụng phương pháp multiplex PCR để đánh giá chất lượng của mẫu kiểm nghiệm nhờ vào việc khuếch đại vùng DNA trên gene ribosome 18 S chuyên biệt ở bò. Sản phẩm khuếch đại là đoạn DNA của lactoferrin. Tác giả dựa vào sự khác nhau ở trình tự ty thể chuyên biệt để xác định thịt bò. Độ đặc hiệu của phương pháp này được xác nhận dựa vào sự vắng mặt của sản phẩm PCR tương đồng có thể phát hiện sử dụng những mẫu thực phẩm liên quan mà không có thịt và bột xương bò, hoặc những mẫu DNA từ động vật có xương sống mà những thứ bỏ đi của chúng thường có trong thức ăn chăn nuôi. Phương pháp này có thể phát hiện sự hiện diện của thịt bò trong thực phẩm khi những mẫu thực phẩm này chứa > 0,02 % thịt và bột xương bò. Hơn nữa, phương pháp này ít ảnh hưởng bởi việc xử lý nhiệt kéo dài. Độ đặc hiệu, thuận tiện và nhạy của phương pháp này cho thấy rằng nó có thể được sử dụng để phát hiện thịt bò.
Arslan & ctv (2006) đã nghiên cứu ảnh hưởng của cách chế biến thịt đối với việc phát hiện thịt bò đã qua xử lý nhiệt bằng kỹ thuật PCR. Nhóm tác giả đã xử lý thịt bằng cách luộc ở 97,5oC trong 140 phút, 200 phút, 230 phút; quay ở 200oC trong 80 phút, 120 phút, 150 phút hoặc hấp khử trùng ở 120oC trong 30 phút, 60 phút, 90 phút; rán ở 115oC trong 45 phút, sau đó rán thêm cho đến khi không còn mùi thơm của thịt. Sản phẩm khuếch đại là 271 bp của DNA ty thể. Kết quả cho thấy rằng ngoại trừ mẫu thịt bò rán ở 80 phút, thịt bò được phát hiện trong tất cả các mẫu còn lại.
Năm 2007, Jain và ctv cũng sử dụng phương pháp multiplex PCR để phân biệt 7 loại thịt heo, gà, bò, trâu, dê, cừu, ngựa. Tác giả sử dụng forward primer và reverse primer cho heo, gà, trâu, bò, dê, cừu, ngựa giống như Matsunaga và ctv, 1999. Tác giả sử dụng reverse primer cho trâu là reverse primer của bò. Kết quả sản phẩm khuếch đại của dê, gà, bò, trâu, cừu, heo và ngựa lần lượt là 157 bp, 227bp, 274bp, 274bp, 331bp, 398bp, và 439bp. Như vậy, bò và trâu có sản phẩm PCR cùng kích thước. Nên tác giả khuyến cáo rằng cần phải thiết kế một reverse primer riêng cho trâu.
Trịnh Thị Thanh Huyền và ctv (2007) cũng đã sử dụng phương pháp multiplex – PCR để phân biệt thịt cừu, heo, bò. Nghiên cứu đã xác định được quy trình thích hợp, trong đó lượng FSIM: RP: RBC: RS lần lượt là 12: 25: 7: 5 pmol, nhiệt độ và thời gian của chu kỳ nhiệt ở giai đoạn lặp lại là: biến tính ở 94oC/1 phút, bắt cặp ở 54oC/ 45 giây, kéo dài ở 72oC/ 1phút. Nồng độ thấp nhất của thịt cừu, bò mà phản ứng multiplex-PCR có thể phát hiện là 1 ng/μl.
Chương 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành
Đề tài được thực hiện từ 10/2009 đến 5/2010
Việc ly trích DNA và thực hiện PCR được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ môi trường – Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3.2 Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Xây dựng quy trình m-PCR phân biệt thịt dê, cừu, heo, gà, bò lẫn trâu 3.2.2 Ứng dụng quy trình m-PCR
Khảo sát m-PCR trong việc phát hiện 6 loại thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong hỗn hợp DNA từ thịt tươi, thịt chế biến và bột thịt.
3.3 Vật liệu
3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA
Hai nhóm mẫu được dùng trong đề tài này là:
- Mẫu cơ vân các loại thịt heo, gà, bò, dê, cừu được lấy tại lò mổ ở Củ Chi, TP HCM
- Mẫu bột xương thịt sử dụng trong chế biến thức ăn gia súc của các hãng sản xuất thức ăn gia súc.
3.3.2 Primer
3.3.2.1 Primer dùng trong kỹ thuật m-PCR để phân biệt thịt dê, cừu, heo, gà, bò và/hoặc trâu
- Forward primer:
Một forward primer được dùng cho phản ứng m-PCR, thiết kế dựa vào vùng bảo tồn trên DNA ty thể của các loài heo, gà, dê, cừu, bò (Matsunaga và ctv, 1999); ký hiệu FSIM. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
FSIM: 5’ – GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA – 3’
- Các reverse primer:
Các reverse primer được thiết kế cho từng loài gia súc dê, gà, cừu, heo, bò dựa trên trình tự không bảo tồn của DNA ty thể, được ký hiệu là RG (dê), RCh (gà), RS (cừu), RP (heo), RCB (bò) có trình tự như sau (Matsunaga và ctv, 1999):
¾ RG: 5’ – CTCGACAAATGTGAGTTACAGAGGGA – 3’
¾ RCh: 5’ – AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG – 3’
¾ RS: 5’ – CTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGCA – 3’
¾ RP: 5’ – GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA – 3’
¾ RCB: 5’ – CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG – 3’
Cặp primer FSIM & RCB của Matsunaga và ctv (1999) cũng được sử dụng để phát hiện thịt trâu (Jain và ctv 2007)
3.3.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
Hóa chất tách chiết DNA: Tris HCl, NaCl, SDS, EDTA, protein K, sodium acetate,
isoamyl alcohol, phenol, chloroform, ethanol, TE 1X.
Hóa chất của phản ứng PCR: Taq DNA polymerase 5UI/μl (Promega), dung dịch đệm 10X (Promega), dNTP 25mM (Promega), MgCl2 25 mM (Promega), các primer (IDT), nước cất 2 lần (khử ion, hấp vô trùng, chiếu UV, pH 6,8 – 7).
Hóa chất điện di: Agarose, TBE 0,5 X (Tris borate EDTA, pH 8,3), loading dye 6X,
ladder 100bp, 200bp, ethidium bromide.
Thiết bị và dụng cụ: Tủ sấy (Jencons – PLS), water bath (Memmert), autoclave (Tommy), máy cất nước (khử ion) (Branstead), máy ly tâm (Mikro Z2K/Sigma 3K30C), tủ trữ mẫu và hóa chất (Reetech, Brandt, Sanyo), máy nghiền mẫu (Model A11, IKA-Đức), máy chụp gel (Biorad), máy luân nhiệt, bộ điện di (Biorad), máy đo OD (Hewlett Packard), micropipet, đầu tip, eppendorf, kéo, chày, kẹp...
3.4 Phương pháp tiến hành 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu
Mỗi loại thịt được lấy khoảng 500g cho vào từng túi nilon sạch kích thước 5 x 10 cm, dán nhãn cho mỗi loại thịt, trữ trong thùng đá, đem về phòng thí nghiệm, trữ ở -700C.
Mẫu bột xương thịt được lấy khoảng 6 mẫu (100g/mẫu) từ các công ty chế biến thức ăn gia súc.
3.4.2 Tách chiết DNA
Sau khi rã đông mẫu ở nhiệt độ phòng, việc tách chiết DNA được thực hiện theo dẫn liệu của Lương Quý Phương (2006). Cho khoảng 0,1g mẫu vào eppendorf 1,5 ml, dùng chày nghiền nhuyễn mẫu; cho vào 60 μl dung dịch đệm tách chiết (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA và 1% SDS, pH 8) và 3 μl dung dịch protease K (20 mg/ml); hỗn hợp được ủ ở 55oC trong 1 giờ. Sau đó, thêm vào hỗn hợp 375μl nước cất khử ion vô trùng, vortex 30 giây. Cho vào hỗn hợp 200 μl dung dịch hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1); vortex trong 1 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 100C. Lấy phần nước nổi bên trên chuyển vào eppendorf mới đã có sẵn 1ml dung dịch cồn tuyệt đối; trộn đều; ủ -20oC trong 1 giờ. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC; phần cặn được để ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô hoàn toàn. Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70%. Sau khi làm khô cặn trong tủ ấm ở 55oC, cho vào ống 200 μl dung dịch TE và ủ 55oC trong 2 giờ để làm tan cặn. Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được trữ ở - 20oC hoặc sử dụng ngay.
Độ tinh sạch DNA được kiểm tra bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453). Các mẫu DNA được tách chiết có tỷ số OD260nm/OD280nm > 1,6 được sử dụng cho PCR. Hàm lượng DNA được ước lượng theo công thức:
DNA (ng/μl) = [62,9*OD260nm – 36*OD280nm]*độ pha loãng
3.4.3 Xây dựng quy trình m-PCR phát hiện thịt có nguồn gốc từ heo, gà, dê, cừu, bò và/hoặc trâu bò và/hoặc trâu
3.4.3.1 Phát hiện từng loại thịt bằng các phản ứng PCR đơn
Mục tiêu của thí nghiệm là tối ưu hóa quy trình PCR để phát hiện riêng lẻ từng loại thịt tươi, sử dụng primer được thiết kế bởi Matsunaga & ctv (1999). Dự kiến thành phần hóa chất và quy trình nhiệt ban đầu của từng phản ứng PCR như Bảng 3.1 và Bảng 3.2.
Bảng 3.1: Thành phần hóa chất cho từng phản ứng PCR thịt tươi Tên hóa chất Nồng độ phản ứng
Dung dịch đệm PCR 1X
MgCl2 2 mM
Forward primer (FSIM) 12 pmol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
dNTP 200 μM/mỗi loại
Taq 1,25 UI
DNA mỗi loại 100 ng/1 phản ứng
H2O cất Vừa đủ 30μl
(Trịnh Thị Thanh Huyền, 2007)
(*) Nồng độ reverse primer cho mỗi loại thịt trong từng PCR được điều chỉnh sao cho phù hợp, khởi
đầu với 7 pmol/30μl đối với RG (dê), RCh (gà), và RCB (sử dụng để phát hiện chung thịt bò và thịt trâu); 5 pmol/30μl đối với RS (cừu); và 25 pmol/30μl đối với RP (heo). Trong đó, nồng độ của RCB, RP, RS là theo Trịnh Thị Thanh Huyền (2007); còn nồng độ RCh, RG theo tác giả của nghiên của cứu này.
Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt dự kiến của phản ứng PCR thịt tươi
Tiền biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Kéo dài cuối cùng 94oC 4 phút 94oC 1 phút 54oC 45 giây 72oC 1 phút 72oC 5 phút Lặp lại 35 chu kỳ (Trịnh Thị Thanh Huyền, 2007)
3.4.3.2 Thiết lập và tối ưu hóa quy trình m-PCR
Phản ứng m-PCR nhằm phát hiện cùng lúc sự hiện diện của các loại thịt có nguồn gốc từ các loài động vật khác nhau được thực hiện, sử dụng các primer đã dùng trong quy trình PCR đơn xác định từng loại thịt ở mục 3.4.3.1. Thực hiện m-PCR theo quy trình giống như PCR riêng lẻ xác định từng loại thịt ở mục 3.4.3.1 chỉ khác là cho tất cả các primer vào chung một phản ứng.
Phản ứng được tối ưu hóa bằng cách điều chỉnh: nồng độ các primer, chu kỳ nhiệt, nồng độ Mg2+
Sau khi có được quy trình m-PCR thích hợp để phát hiện các loại thịt heo, gà, dê, cừu, bò/&trâu đã được xác định, các phản ứng được lập lại 3 lần để khẳng định tính ổn định của quy trình.
3.4.4 Ứng dụng m-PCR để phát hiện thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà
Quy trình m-PCR vừa được xây dựng dùng để phát hiện thịt heo, gà, dê, cừu, trâu lẫn bò trong các loại mẫu thử nghiệm khác nhau:
- Các hỗn hợp DNA
- Hỗn hợp thịt chế biến có xử lý nhiệt và không xử lý nhiệt. - Mẫu bột thịt
3.4.4.1 Xác định giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của m-PCR
Để xác định nồng độ thấp nhất của DNA heo, gà, trâu, bò, dê, cừu mà m-PCR có thể phát hiện được, thí nghiệm được thực hiện m-PCR với DNA template là 14 hỗn hợp DNA với mỗi hỗn hợp có nồng độ DNA bằng nhau của heo, gà, trâu, bò, dê, cừu và lần lượt bằng 100ng/ μl; 50ng/μl; 25ng/μl; 10 ng/μl; 2,5 ng/μl; 1 ng/μl; 0,25 ng/μl; 0,1 ng/μl; 0,025 ng/μl; 0,01 ng/μl; 0,0025 ng/μl, 0,001 ng/μl; 0,00025 ng/μl; 0,0001ng/μl.
3.4.4.2 Thực hiện m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu
Nhằm tạo cơ sở cho việc thực hiện m-PCR ở các nồng độ DNA khác nhau và để xác định tỷ lệ thấp nhất của DNA trâu, bò, dê, cừu mà m-PCR còn phát hiện được, việc phối trộn DNA được thực hiện theo các tỷ lệ khác nhau như bảng 3.4.
Lý do phối trộn với tỷ lệ theo bảng 3.4 như sau: Nguyên liệu để sản xuất bột thịt trong thức ăn gia súc chủ yếu là phế phẩm từ các lò mổ gia súc, gia cầm. Trong đó, phế phẩm của heo và gà là chủ yếu. Nên đề tài phối trộn tỷ lệ heo và gà bằng nhau và tăng dần. Còn thịt có nguồn gốc từ thú nhai lại có nguy cơ nhiễm bệnh BSE hoặc vì lý do nào đó (ví dụ như tôn giáo, dị ứng..) mà người ta không muốn sử dụng thịt từ thú nhai lại. Nên đề tài phối trộn thịt trâu, bò, dê, cừu với tỷ lệ bằng nhau và giảm dần.
Bảng 3.4: Tỷ lệ DNA heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp STT Kí hiệu hỗn hợp Tỷ lệ của hỗn hợp DNA 1 M1 30:30:10:10:10:10 2 M2 40:40:5:5:5:5 3 M3 48:48:1:1:1:1 4 M4 49:49:0,5:0,5:0,5:0,5 5 M5 49,8:49,8:0,1:0,1:0,1:0,1 6 M6 49,9:49,9:0,05:0,05:0,05:0,05 7 M7 49,94:49,94:0,03:0,03:0,03:0,03
3.4.4.3 Thực hiện m-PCR để phát hiện thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt
Nhằm tạo cơ sở cho việc xác định mức độ biến tính và xác định sự phù hợp của quy trình đối với DNA tách chiết từ thịt đã xử lý nhiệt, trước tiên chúng tôi thực hiện
m-PCR cho hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt. Thí nghiệm này được tiến hành với các