3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu
Mỗi loại thịt được lấy khoảng 500g cho vào từng túi nilon sạch kích thước 5 x 10 cm, dán nhãn cho mỗi loại thịt, trữ trong thùng đá, đem về phòng thí nghiệm, trữ ở -700C.
Mẫu bột xương thịt được lấy khoảng 6 mẫu (100g/mẫu) từ các công ty chế biến thức ăn gia súc.
3.4.2 Tách chiết DNA
Sau khi rã đông mẫu ở nhiệt độ phòng, việc tách chiết DNA được thực hiện theo dẫn liệu của Lương Quý Phương (2006). Cho khoảng 0,1g mẫu vào eppendorf 1,5 ml, dùng chày nghiền nhuyễn mẫu; cho vào 60 μl dung dịch đệm tách chiết (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA và 1% SDS, pH 8) và 3 μl dung dịch protease K (20 mg/ml); hỗn hợp được ủ ở 55oC trong 1 giờ. Sau đó, thêm vào hỗn hợp 375μl nước cất khử ion vô trùng, vortex 30 giây. Cho vào hỗn hợp 200 μl dung dịch hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1); vortex trong 1 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 100C. Lấy phần nước nổi bên trên chuyển vào eppendorf mới đã có sẵn 1ml dung dịch cồn tuyệt đối; trộn đều; ủ -20oC trong 1 giờ. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC; phần cặn được để ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô hoàn toàn. Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70%. Sau khi làm khô cặn trong tủ ấm ở 55oC, cho vào ống 200 μl dung dịch TE và ủ 55oC trong 2 giờ để làm tan cặn. Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được trữ ở - 20oC hoặc sử dụng ngay.
Độ tinh sạch DNA được kiểm tra bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453). Các mẫu DNA được tách chiết có tỷ số OD260nm/OD280nm > 1,6 được sử dụng cho PCR. Hàm lượng DNA được ước lượng theo công thức:
DNA (ng/μl) = [62,9*OD260nm – 36*OD280nm]*độ pha loãng
3.4.3 Xây dựng quy trình m-PCR phát hiện thịt có nguồn gốc từ heo, gà, dê, cừu, bò và/hoặc trâu bò và/hoặc trâu
3.4.3.1 Phát hiện từng loại thịt bằng các phản ứng PCR đơn
Mục tiêu của thí nghiệm là tối ưu hóa quy trình PCR để phát hiện riêng lẻ từng loại thịt tươi, sử dụng primer được thiết kế bởi Matsunaga & ctv (1999). Dự kiến thành phần hóa chất và quy trình nhiệt ban đầu của từng phản ứng PCR như Bảng 3.1 và Bảng 3.2.
Bảng 3.1: Thành phần hóa chất cho từng phản ứng PCR thịt tươi Tên hóa chất Nồng độ phản ứng
Dung dịch đệm PCR 1X
MgCl2 2 mM
Forward primer (FSIM) 12 pmol
dNTP 200 μM/mỗi loại
Taq 1,25 UI
DNA mỗi loại 100 ng/1 phản ứng
H2O cất Vừa đủ 30μl
(Trịnh Thị Thanh Huyền, 2007)
(*) Nồng độ reverse primer cho mỗi loại thịt trong từng PCR được điều chỉnh sao cho phù hợp, khởi
đầu với 7 pmol/30μl đối với RG (dê), RCh (gà), và RCB (sử dụng để phát hiện chung thịt bò và thịt trâu); 5 pmol/30μl đối với RS (cừu); và 25 pmol/30μl đối với RP (heo). Trong đó, nồng độ của RCB, RP, RS là theo Trịnh Thị Thanh Huyền (2007); còn nồng độ RCh, RG theo tác giả của nghiên của cứu này.
Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt dự kiến của phản ứng PCR thịt tươi
Tiền biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Kéo dài cuối cùng 94oC 4 phút 94oC 1 phút 54oC 45 giây 72oC 1 phút 72oC 5 phút Lặp lại 35 chu kỳ (Trịnh Thị Thanh Huyền, 2007)
3.4.3.2 Thiết lập và tối ưu hóa quy trình m-PCR
Phản ứng m-PCR nhằm phát hiện cùng lúc sự hiện diện của các loại thịt có nguồn gốc từ các loài động vật khác nhau được thực hiện, sử dụng các primer đã dùng trong quy trình PCR đơn xác định từng loại thịt ở mục 3.4.3.1. Thực hiện m-PCR theo quy trình giống như PCR riêng lẻ xác định từng loại thịt ở mục 3.4.3.1 chỉ khác là cho tất cả các primer vào chung một phản ứng.
Phản ứng được tối ưu hóa bằng cách điều chỉnh: nồng độ các primer, chu kỳ nhiệt, nồng độ Mg2+
Sau khi có được quy trình m-PCR thích hợp để phát hiện các loại thịt heo, gà, dê, cừu, bò/&trâu đã được xác định, các phản ứng được lập lại 3 lần để khẳng định tính ổn định của quy trình.
3.4.4 Ứng dụng m-PCR để phát hiện thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà
Quy trình m-PCR vừa được xây dựng dùng để phát hiện thịt heo, gà, dê, cừu, trâu lẫn bò trong các loại mẫu thử nghiệm khác nhau:
- Các hỗn hợp DNA
- Hỗn hợp thịt chế biến có xử lý nhiệt và không xử lý nhiệt. - Mẫu bột thịt
3.4.4.1 Xác định giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của m-PCR
Để xác định nồng độ thấp nhất của DNA heo, gà, trâu, bò, dê, cừu mà m-PCR có thể phát hiện được, thí nghiệm được thực hiện m-PCR với DNA template là 14 hỗn hợp DNA với mỗi hỗn hợp có nồng độ DNA bằng nhau của heo, gà, trâu, bò, dê, cừu và lần lượt bằng 100ng/ μl; 50ng/μl; 25ng/μl; 10 ng/μl; 2,5 ng/μl; 1 ng/μl; 0,25 ng/μl; 0,1 ng/μl; 0,025 ng/μl; 0,01 ng/μl; 0,0025 ng/μl, 0,001 ng/μl; 0,00025 ng/μl; 0,0001ng/μl.
3.4.4.2 Thực hiện m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu
Nhằm tạo cơ sở cho việc thực hiện m-PCR ở các nồng độ DNA khác nhau và để xác định tỷ lệ thấp nhất của DNA trâu, bò, dê, cừu mà m-PCR còn phát hiện được, việc phối trộn DNA được thực hiện theo các tỷ lệ khác nhau như bảng 3.4.
Lý do phối trộn với tỷ lệ theo bảng 3.4 như sau: Nguyên liệu để sản xuất bột thịt trong thức ăn gia súc chủ yếu là phế phẩm từ các lò mổ gia súc, gia cầm. Trong đó, phế phẩm của heo và gà là chủ yếu. Nên đề tài phối trộn tỷ lệ heo và gà bằng nhau và tăng dần. Còn thịt có nguồn gốc từ thú nhai lại có nguy cơ nhiễm bệnh BSE hoặc vì lý do nào đó (ví dụ như tôn giáo, dị ứng..) mà người ta không muốn sử dụng thịt từ thú nhai lại. Nên đề tài phối trộn thịt trâu, bò, dê, cừu với tỷ lệ bằng nhau và giảm dần.
Bảng 3.4: Tỷ lệ DNA heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp STT Kí hiệu hỗn hợp Tỷ lệ của hỗn hợp DNA 1 M1 30:30:10:10:10:10 2 M2 40:40:5:5:5:5 3 M3 48:48:1:1:1:1 4 M4 49:49:0,5:0,5:0,5:0,5 5 M5 49,8:49,8:0,1:0,1:0,1:0,1 6 M6 49,9:49,9:0,05:0,05:0,05:0,05 7 M7 49,94:49,94:0,03:0,03:0,03:0,03
3.4.4.3 Thực hiện m-PCR để phát hiện thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt
Nhằm tạo cơ sở cho việc xác định mức độ biến tính và xác định sự phù hợp của quy trình đối với DNA tách chiết từ thịt đã xử lý nhiệt, trước tiên chúng tôi thực hiện
m-PCR cho hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt. Thí nghiệm này được tiến hành với các hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt theo bảng 3.5.
Cách phối trộn thịt theo bảng 3.5 như sau: Mỗi loại thịt được lấy khoảng 300g nghiền nhuyễn bằng máy nghiền mẫu. Sau đó cân và trộn các loại thịt với tỷ lệ quy định (bảng 3.6). Mỗi túi mẫu có khối lượng 20g. Mỗi hỗn hợp được chia thành 7 phần (1 phần không xử lý nhiệt, 6 phần để xử lý nhiệt) cho vào các túi nilon chịu nhiệt (hoặc gói bằng giấy bạc) có dán nhãn ghi rõ thành phần tỉ lệ, nhiệt độ và thời gian xử lý nhiệt. Với 6 nhóm xử lý nhiệt, 5 nhóm hỗn hợp thịt xử lý bằng nồi hấp autoclave ở các nhiệt độ và thời gian: 80oC/15’; 120oC/15’; 120oC/30’; 130oC/15’; 130oC/30’; 1 nhóm hỗn hợp thịt sử dụng tủ sấy để xử lý thịt ở 180oC/15’. Làm nguội và trữ ở -70oC cho đến khi sử dụng.
Lý do phối trộn với tỷ lệ theo bảng 3.5 tương tự như lý do phối trộn theo bảng 3.4
3.4.4.4 Thực hiện m-PCR để phát hiện thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt hỗn hợp thịt xử lý nhiệt
Để khẳng định khả năng phát hiện các loại thịt heo, gà, dê, cừu, bò/&trâu đã qua xử lý nhiệt đồng thời xác định nồng độ thấp nhất của thịt dê, cừu, bò, trâu mà m-PCR có thể phát hiện được. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm này với các hỗn hợp thịt theo
bảng 3.6.
3.4.4.5 Thực hiện m-PCR với bột thịt trên thị trường
Bảng 3.5: Hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt
Kí hiệu hỗn hợp thịt chế biến xử lý nhiệt TT Tỷ lệ thịt heo, gà, trâu, bò, dê,
cừu trong các hỗn hợp Kí hiệu hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt 80oC/ 15’ 120oC/ 15’ 120oC/ 30’ 130oC/ 15’ 130oC/ 30’ 180oC/ 15’ 1 30:30:10:10:10:10 N1 M2.1 M3.1 M4.1 M5.1 M6.1 M7.1 2 40:40:5:5:5:5 N2 M2.2 M3.2 M4.2 M5.2 M6.2 M7.2 3 48:48:1:1:1:1 N3 M2.3 M3.3 M4.3 M5.3 M6.3 M7.3 4 49:49:0,5:0,5:0,5:0,5 N4 M2.4 M3.4 M4.4 M5.4 M6.4 M7.4 5 49,8:49,8:0,1:0,1:0,1:0,1 N5 M2.5 M3.5 M4.5 M5.5 M6.5 M7.5 6 49,9:49,9:0,05:0,05:0,05:0,05 N6 M2.6 M3.6 M4.6 M5.6 M6.6 M7.6 7 49,94:49,94:0,03:0,03:0,03:0,03 N7 M2.7 M3.7 M4.7 M5.7 M6.7 M7.7
Sơđồ 3.1: Sơđồ nghiên cứu
m-PCR (heo, gà, dê, cừu, trâu/& bò)
Xử lý nhiệt Không xử lý nhiệt
Hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu,
bò, dê, cừu
- Chuẩn bị mẫu: Thịt tươi, thịt chế biến, bột thịt - Ly trích DNA
Điều chỉnh quy trình m-PCR phát hiện heo, gà, dê, cừu, trâu/&bò
Ứng dụng quy trình đối với hỗn hợp DNA từ:
Thịt tươi Thịt chế biến Bột thịt
Chương 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Xây dựng quy trình m-PCR
4.1.1 PCR phát hiện từng loại thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu
Từng phản ứng PCR được tiến hành với thành phần hóa chất như bảng 3.1, quy
trình nhiệt như bảng 3.2. DNA template của mỗi phản ứng được tách chiết từ thịt tươi
đã biết trước, primer theo Matsunaga & ctv (1999). Kết quả thu được là mỗi giếng có một band sản phẩm PCR chuyên biệt cho từng loài heo, cừu, bò, gà, dê có kích thước tương ứng 398 bp, 331 bp, 274 bp, 227 bp, 157 bp (Hình 4.1).
Hình 4.1: Sản phẩm PCR riêng lẻ của heo, cừu, bò, gà, dê
Cytochrome b của bò và trâu có sự tương đồng cao vì thế chúng tôi đã dùng cặp primer FSIM, RCB phát hiện thịt bò của Matsunaga và ctv (1999) để phát hiện thịt trâu. Nồng độ primer FSIM:RCB sử dụng là 12:7. Kết quả cho thấy cặp primer FSIM, RCB có thể phát hiện cả thịt bò lẫn thịt trâu (Hình 4.2). Jain và ctv (2007) cũng đã sử dụng cặp primer FSIM&RCB để phát hiện thịt trâu. Kết quả thu được sản phẩm khuếch đại DNA từ thịt trâu cũng có kích thước 274bp.
Heo cừu bò lad gà dê
100 bp 500 bp
Hình 4.2: Sản phẩm PCR của thịt bò và trâu
Mục tiêu của thí nghiệm này là xác định quy trình PCR để phát hiện từng loại thịt tươi riêng biệt. Từ kết quả ở hình 4.1 và hình 4.2 cho thấy thành phần hóa chất và quy trình nhiệt ở bảng 3.1, bảng 3.2 là phù hợp. Nồng độ FSIM là 12 pmol/30μl và các reverse primer RG, RCh, RCB, RS, RP lần lượt là 7, 7, 7, 5, 25 pmol/30μl. Trong đó, RCB được sử dụng chung để phát hiện thịt bò lẫn thịt trâu
Phương pháp PCR được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu phát hiện nguồn gốc loài của các loại thịt. Các primer FSIM, RG, RCh, RCB, RS, RP cũng được sử dụng ở nhiều nghiên cứu. Ví dụ, Pinto & ctv (2005) đã sử dụng primer FSIM, RP để phát hiện thịt heo trong xúc xích tươi. Năm 2007, Irfan sử dụng cặp primer FSIM, RG để phát hiện thịt dê. Jain & ctv (2007) sử dụng FSIM, RG, RCh, RCB, RS, RP để phát hiện thịt dê, gà, trâu/ bò, cừu, heo.
Như vậy, các primer của Matsunaga và ctv (1999) gồm FSIM, RG, RCh, RP, RS, RCB thích hợp cho việc phát hiện các loại thịt dê, gà, heo, cừu, trâu lẫn bò.
4.1.2 Quá trình thiết lập và tối ưu hóa m-PCR
Bước đầu tiên trong quá trình thiết lập và tối ưu hóa m-PCR, đề tài đã thực hiện phản ứng m-PCR với thành phần phản ứng và quy trình nhiệt theo PCR riêng lẻ phát hiện từng loại thịt. Nghĩa là thành phần phản ứng và quy trình nhiệt giống như bảng 3.1 và bảng 3.2 chỉ khác là các primer được trộn chung trong một phản ứng với tỉ lệ
FSIM:RG:RCh:RCB:RS:RP là 12: 7:7:7:5:25. Kết quả được điện di ở hình 4.3
Bò Trâu Lad
500 bp 274 bp
Hình 4.3: Kết quả m-PCR theo PCR riêng lẻ
Kết quả ở hình 4.3 cho thấy band gà, cừu, heo là rõ còn band dê và bò hơi mờ. Theo Octavian (1997) và Sambrook và Russell (2001), trong phản ứng m-PCR, nếu có một số sản phẩm PCR yếu (band DNA mờ, không rõ) thì nên tăng lượng mồi của sản phẩm yếu. Do vậy, khởi đầu trong việc tối ưu hóa m-PCR là điều chỉnh lượng primer.
Nồng độ primer được điều chỉnh theo Octavian (1997) và Sambrook và Russell (2001). Kết quả tỷ lệ theo nồng độ các primer FSIM:RG:RCh:RCB:RS:RP thích hợp cho phản ứng m-PCR phát hiện các loại thịt heo, gà, dê, cừu, trâu lẫn bò là 12: 7: 7:10: 5: 25 (hình 4.4) Hình 4.4: Kết quả tối ưu m-PCR Dê (157bp) Gà Bò Heo Cừu m-PCR lad m-PCR Dê Gà Bò/&trâu Cừu Heo
4.1.3 Thí nghiệm xác định khả năng phát hiện thịt trâu của m-PCR
Hình 4.5: Kết quả thí nghiệm khẳng định m-PCR phát hiện thịt trâu
1-heo; 2-cừu; 3-gà; 4-dê; 5- bò; 6-trâu; 7- Bò, heo, gà, dê, cừu; 8- Lad; 9-Trâu, heo, gà, dê, cừu; 10- Trâu, bò, heo, gà, dê, cừu; 11-trâu, bò; 12-ĐC (-)
Thí nghiệm được thực hiện để xác định khả năng phát hiện thịt trâu của m-PCR sử dụng primer RCB được Matsunaga & ctv (1999) thiết kế phát hiện thịt có nguồn gốc từ bò.
Kết quả ở hình 4.5 cho thấy m-PCR chưa thể phân biệt được thịt bò với thịt trâu. Nếu mục tiêu chỉ phát hiện có thịt bò hoặc thịt trâu thì m-PCR này đã đáp ứng được. Còn nếu để phân biệt chính xác thịt bò với thịt trâu (ví dụ trong vấn đề gian lận thương mại) thì cần phải có phương pháp phát hiện chính xác.
Trên thế giới cũng có nhiều công trình nghiên cứu về phân biệt trâu và bò. Rahman &ctv (2007) đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP để phân biệt sữa bò và sữa trâu. Đầu tiên, nhóm tác giả khuếch đại một đoạn DNA của gen cytochrome b có kích thước là 359 bp chung cho cả sữa bò và sữa trâu. Tiếp theo dùng enzyme TaqI để cắt sản phẩm PCR (359bp). Kết quả ra 2 đoạn 191 bp và 168 bp là sữa trâu, còn nếu không bị cắt là sữa bò.
4.2 Ứng dụng m-PCR phát hiện thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà
4.2.1. Xác định giới hạn nồng độ DNA mỗi loài có thể phát hiện được của m-PCR
Thực hiện m-PCR với DNA template là 14 hỗn hợp DNA (được kí hiệu từ L1 đến L14) với mỗi hỗn hợp có nồng độ DNA bằng nhau của heo, gà, trâu, bò, dê, cừu lần lượt đều bằng 100ng/μl; 50ng/μl; 25ng/μl; 10 ng/μl; 2,5 ng/μl; 1 ng/μl; 0,25 ng/μl; 0,1 ng/μl; 0,025 ng/μl; 0,01 ng/μl; 0,0025 ng/μl, 0,001 ng/μl; 0,00025 ng/μl;
0,0001ng/μl .
Kết quả điện di ở Hình 4.6 và Bảng 4.1 cho thấy nồng độ DNA thấp nhất có thể phát hiện của m-PCR: Gà là 0,0001 ng/μl, heo là 0,00025 ng/μl, cừu là 0,0025 ng/μl, trâu/&bò là 0,0025 ng/μl, dê là 0,0025 ng/μl. Hình 4.6: Giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của m-PCR Bảng 4.1: Giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của m-PCR Kết quả m-PCR Kí hiệu hỗn hợp Nồng độ
ng/μl gà heo dê cừu Trâu /& bò
L1 100 + + + + + L2 50 + + + + + L3 25 + + + + + L4 10 + + + + + L5 2,5 + + + + + L6 1 + + + + + L7 0,25 + + + + + L8 0,1 + + + + + L9 0,025 + + + + + L10 0,01 + + + + + L11 0,0025 + + + + + L12 0,001 + + - - - L13 0,00025 + + - - - L14 0,0001 + - - - -
Như vậy, m-PCR có độ nhạy cao nhất khi phát hiện thịt gà (0,0001 ng/μl), kế đến là thịt heo (0,00025 ng/μl). Độ nhạy phát hiện thịt cừu, dê và trâu/&bò là bằng