- Cách 2. Mẫu cấy ựược cắt trên giấy khô, cấy trên môi trường ựồng nuôi cấy, sau ựó dùng micropipet hút dịch vi khuẩn trên nhỏ vào mẫu, mỗi mẫu cấy chỉ nhỏ 10ộl dung dịch vi khuẩn.
- Cách 3: Mẫu cấy ựược cắt trong môi trường ựồng nuôi cấy, sau ựó chuyển sang lây nhiễm trong dịch vi khuẩn trong 5 phút.
- Cách 4: Mẫu cấy ựược cắt trong môi trường ựồng nuôi cấy, sau ựó cấy trên môi trường ựồng nuôi cấy, rồi dùng micropipet hút dịch vi khuẩn trên nhỏ vào mẫu, mỗi mẫu cấy chỉ nhỏ 10ộl dung dịch vi khuẩn.
- Cách 5: Mẫu cấy ựược cắt trong môi trường ựồng nuôi cấy có vi khuẩn pha loãng.
Công
thức Cách lây nhiễm Ghi chú 1 đC (không nhiễm khuẩn) 2 Cách 1 3 Cách 2 4 Cách 3 5 Cách 4 6 Cách 5 Nguồn mẫu: loại mẫu tốt nhất từ thắ nghiệm 1 Lượng mẫu: 450 mẫu/công thức. TNC: thời gian tiền nuôi cấy tốt nhất từ thắ nghiệm 2 đNC: 3 ngày
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ34 tiếp theo.
3.2.1.4 Thắ nghiệm 4
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens
Công thức Thời gian ựồng nuôi cấy
(ngày) Ghi chú 1 đối chứng (không nhiễm khuẩn) 2 1 3 3 4 5 5 7 Nguồn mẫu: loại mẫu tốt nhất từ thắ nghiệm 1
Cách lây nhiễm: cách lây nhiễm tốt nhất từ thắ nghiệm 3
Tiền nuôi cấy: thời gian tiền nuôi cấy tốt nhất từ thắ nghiệm 2
Lượng mẫu: 450 mẫu/công thức
3.2.1.5 Thắ nghiệm 5
đánh giá tác ựộng tổ hợp của các công thức tối ưu tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens
Công thức Phương pháp Ghi chú
CT1 đC (không nhiễm khuẩn) CT2 Tổ hợp các công thức tối ưu
- Nguồn mẫu: callus
- Vi khuẩn mang gen kháng PTT - Lượng mẫu: 450 mẫu/công thức
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1 Cách bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm ựược thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức ựược bố trắ 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 150 mẫu.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ35
3.2.2.2 điều kiện tiến hành thắ nghiệm
- Phòng nuôi cấy mô có ựiều kiện:
+ Cường ựộ ánh sáng: 2000 Ờ 3000 lux + Nhiệt ựộ: 24 Ờ 27oC
+ Chu kỳ chiếu sáng: 16 giờ chiếu sáng/8giờ tối.
3.2.2.3 Phương pháp nghiên cứu
- Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô hiện hành. - Các loại môi trường sử dụng:
* Môi trường cơ bản MS (Muraskige & Skoog 1962) (phụ lục). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Môi trường ựồng nuôi cấy ựặc: MS (không có NH4NO3) + 20mg/l
AS + 20g/l saccharose + 10g/l glucose + 10mM/l MES + 0.25mg/l BA + 1g/l cassamino acid + 700mg/l L-asparagine monohydrate + 700mg/l L-glutamine + 7g/l agar. pH = 6.
* Môi trường pha loãng vi khuẩn: MS (không có NH4NO3) + 20mg/l AS + 20g/l saccharose + 10g/l glucose + 10mM/l MES + 0.25mg/l BA + 1g/l cassamino acid + 700mg/l L-asparagine monohydrate + 700mg/l L-glutamine. pH = 6.
* Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (LB): 10g/l Tripton + 10g/l NaCl +
5g/l cao nấm men. pH = 7
* Môi trường tái sinh chồi: MS + 0.25mg/l BA + 20g/l saccharose +
7g/l agar. pH = 5.8
* Môi trường diệt khuẩn: môi trường tái sinh chồi + 500mg/l cefotaxime. pH = 5.8
* Môi trường chọn lọc các mẫu mô (callus, protocorm, vảy củ): MS + 60g/l saccharose + 10g/l glucose + 0.25 mg/l BA + 2.5mg/l PPT + 7g/l agar.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ36 pH = 5.8
Môi trường trước khi sử dụng ựược hấp khử trùng ở nhiệt ựộ 121oC trong vòng 20 phút.