2.5.4.1 Các nghiên cứu về sự tái sinh in vitro
Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho cây hoa loa kèn nhằm nhân nhanh các giống sạch bệnh ñã ñược nhiều nhà khoa nghiên cứu. Trong các nghiên cứu cơ bản ban ñầu, hoa loa kèn có thể ñược tiến hành nuôi cấy trên rất nhiều bộ phận khác nhau nhưñỉnh sinh trưởng, ñoạn thân, vảy củ, mô lá, bầu hoa, cánh hoa, chỉ nhị, ... Asjes và cộng sự (1974) ñã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy meristem ñể tạo ra các giống hoa loa kèn hoàn toàn sạch virus ở Hà Lan. Năm 1979, Ramsay-J-L và cộng sự cũng tiến hành nuôi cấy bầu hoa của hoa loa kèn thành công trên môi trường MS + 5% ñường + 1ppm 2,4D + 2ppm BA. Các nhà nghiên cứu người Mỹ Wickremesinhe-E và cộng sự (1995) ñã tạo ñược mô sẹo từ mô lá non của hoa loa kèn khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung B5, 20g/l saccazose, 1ppm 2,4D, 1ppm BA, và 2,0g/l Gelrite trong ñiều kiện bóng tối hoặc chiếu sáng 16h ở nhiệt ñộ 250C. Sau 3 tuần cấy chuyển sang môi trường 0,1ppm 2,4D + 0-5ppm BA, các mô sẹo bắt ñầu phát sinh cơ quan [20].
Qua nhiều nghiên cứu của các tác giả như: W.P.Hackett (1969), Allen (1974), J.A.Simmondds & B.G.Cumming (1976) [20], Stimart & Ascher (1978) [28], S.M.Robb (1957), … ñã khẳng ñịnh vảy củ là nguyên liệu tốt nhất cho việc tái sinh chồi.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………26 Năm 1993, kết quả nghiên cứu của IIcheva-V và cộng sự tại Bungari cũng ñã khẳng ñịnh vảy củ là nguyên liệu tốt nhất cho việc tái sinh chồi trực tiếp từ mô nuôi cấy mà không cần qua giai ñoạn mô sẹo khi ñược cấy trên môi trường Linsmaier và Skoog có bổ sung 0,5mg/l NAA và 0,1mg/l Kinetin. Các cây ñược hình thành ñều mang số nhiễm sắc thể của loài [23].
Vì vậy sử dụng vảy củ làm nguyên liệu chính cho nuôi cấy in vitro tạo mô sẹo phục vụ trong công tác chuyển gen hay tạo chồi khi sản xuất cây giống rất tiện lợi, dễ thành công, có hiệu quả cao hơn nhiều so với việc sử dụng các bộ phận khác của cây hoa loa kèn.
2.5.4.2 Các nghiên cứu về chuyển gen
Trong vấn ñề tạo giống hoa loa kèn mới sử dụng các phương pháp chuyển gen cũng ñược nhiều nhà khoa học nghiên cứu và ñã ñạt ñược các thành công nhất ñịnh
Năm 1998 Watad A.A. và cộng sự ñã tạo thành công cây Lilium longiflorum thông qua hệ thống bắn gen Biolicstics PDS 1000/He vào callus tái sinh từ vảy củ [30].
Năm 2002, tại Triều Tiên, In-Hae Park, Hee-Sung Park chuyển gen thành công vào phấn hoa loa kèn L.longiflorum in vitro sử dụng Agrobacterium mang gen Gus. Trong thí nghiệm sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefaciens pBI121 [24].
Năm 2002, Lipsky A. và cộng sự ñã tạo ñược cây L. longiflorum Thunb kháng virus (CMV) nhờ kỹ thuật bắn gen. Callus xuất phát từ vảy củ có ñộ ñồng ñều thấp sau 6 tháng cấy chuyển. Nghiên cứu chuyển gen ñã ñược thực hiện bằng sử dụng thiết bị bắn gen Finer – type bombardment trên callus 3 hoặc 10 tháng ñược duy trì trong môi trường lỏng ởñiều kiện bóng tối. Callus nuôi cấy trên môi trường lỏng cho phép thu ñược cây chuyển gen bền vững cao hơn 50- 70 lần so với môi trường ñặc [26].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………27 vào một số cây trồng thuộc họ Liliaceae gồm có: Lilium formosanum, Agapanthus
praecox spp. orientalis và Muscari armeniacum. Trong nghiên cứu sử dụng các chủng vi khuẩn chuyển gen A.tumefaciens mang các gen cần chuyển neomycin phosphotransferase II (nptII), hygromycin phosphotransferase (hpt), and intron- containing -glucuronidase (gus-intron) ñó là các chủng: EHA101/pIG121Hm, LBA4404/pIG121Hm, và LBA4404/pIOK233 (Sakea Suzuki & Masaru Nakano, 2002). Kết quả nghiên cứu ñã không thu ñược mô chuyển gen trên giống
Lilium formosanum mặc dù có biểu hiện tạm thời của gen Gus ở callus trong quá trình ñồng nuôi cấy. Tuy nhiên, ñã thu ñược một số cụm tế bào có kháng hygromycin của giống Agapanthus prarcox ssp. orientalis và Muscarri armeniacum trên môi trường có bổ sung hygromycin. Callus kháng hygromycin ñã tái sinh tạo cây hoàn chỉnh qua phôi soma, hầu hết trong số chúng ñược xác ñịnh là cây chuyển gen dựa trên phép thử Gus histochemical assay và phân tích PCR. Bằng lai Southrn Blot ñã phát hiện 1-5 bản sao của gen trong bộ gen của cây chuyển gen của hai giống, trong ñó hầu hết là có một hoặc hai bản sao. Hệ thống chuyển gen này có thể là một công cụñể phát triển trong nghiên cứu về sinh học phân tử [28].
Năm 2003, A.Mercuri và cộng sự (ðức) chuyển gen thành công vào chỉ nhị và ñế hoa của Lilium longiflorum Thunb. cultivar 'Snow Queen' sử dụng chủng vi khuẩn A.tumefaciens LBA4404 mang vector pBin18, vùng T-DNA ñược tách dòng từ EcoRI15 mang ORFs 10, 11 và 12 tương ứng với torol A, B và C, ñược cắt từ Agrobacterium rhizogenes pRi 1855. Callus phát sinh
phôi xuất phát từ vòi nhụy và cuống ñã ñược cấy và ñồng nuôi cấy trong 7 ngày với huyền phù của vi khuẩn Agrobacterium LBA4404, mang binary vector pBin 19 bao gồm nptII gen ñược ñiều khiển bởi Nos promoter và các ñoạn giới hạn T – DNA EcoRI 15, bao gồm Os11 và 12 tương ứng với rol A, B và C ñược cắt từ A. rhizogenes pRI 1855. Các chồi chuyển gen ñã ñược tái
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………28 sinh trên môi trường chọn lọc và dễ dàng nhân nhanh, ra rễ và chuyển ra ñất. Có sựña dạng về kiểu hình của các dòng chuyển gen [27].
Năm 2004, Y.Hoshi và cộng sự (Nhật Bản) ñã chuyển gen thành công vào Oriental hybrid lily, Lilium cv. Acapulco bằng chủng vi khuẩn
A.tumefaciens EHA101/pIG121Hm mang các gen nptII, hpt và gen Gus. Kết quảñã thu ñược 6 dòng lily kháng Hyg từ hơn 200 callus bằng cách làm tổn thương callus với giấy giáp trước khi ñồng nuôi cấy. Callus ñược nuôi cấy trên môi trường MS không có NH4NO3, sử dụng Hyg trong môi trường chọn lọc. Các dòng tái sinh kháng Hyg tạo chồi sau ñó phát triển thành cây khi chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất ñiều tiết sinh trưỏng. Tất cả các cây ñược kết luận chuyển gen nhờ Gus histochemical assay và phân tích PCR [22].
Năm 2004, các tác giả Byung Jooon Ahn và cộng sự ñã chuyển gen bằng súng bắn gen cho huyền phù tế bào của hoa Easter lily (Lilium
longiflorum). Sự biểu hiện tạm thời của gen uidA xuất hiện ở 493 tế bào/ ñĩa petri. ðể chuyển gen bền vững, huyền phù tế bào của lilium longflorum ñược bắn với plasmid bao gồm cucumber mosaic virus (CMV) replicase ñược ñiều khiển bởi Act, 1 promotor và gen Bar ñã ñược ñiều khiển bởi CaMV promotor, 10 cây tái sinh ñã ñược phân tích bởi PCR, 2 trong 10 cây ñã ñược khẳng ñịnh chuyển gen nhờ lai Southern Blot. Hai cây chuyển gen ñược chuyển ñộc lập trong ñó có một cây mang gen Bar, một cây mang cả hai gen gồm CMV replicase và gen Bar. Các cây này ñã ñược xác ñịnh là có khả năng kháng PPT ở nồng ñộ 1000mg/l ở giai ñoạn nở hoa chứng tỏ gen Bar ñã ñược biểu hiện ở toàn bộ là khi ñược ñiều khiển bởi CaMV 35S promtor.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………29 hoa Lilium longiflorum L. qua sự biểu hiện tạm thời của β-glucuronidase bằng vi khuẩn Agrobacterium [25].
Trong những năm gần ñây ñã có nhiều nghiên cứu thành công về phương pháp biến nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium trên một số loài
Lilium. ðây cũng chính là những tiền ñề cho nghiên cứu chuyển gen vào mô tế bào của loài Lilium longiflorum.