NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

* ðối tượng: Giống hoa loa kèn “Lilium longiflorum”, giống ñịa phương ñược trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam.

* Vật liệu: Vẩy củ, callus, ñỉnh chồi. Callus ñược tạo ra từ vảy củ.

Hình 3.1. Callus loa kèn in vitro Hình 3.2.Lilium longiflorum thunb

- Vectơ sử dụng ñể chuyển các gen mục tiêu: chủng EHA 105 mang vectơ ITB2c mang các gen Gus, Bar, CryIA(c) do Viện Sinh học Nhiệt ñới TP HCM- VKHVN cung cấp.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………32

* ðịa ñiểm thực tập: Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

* Thời gian thực tập: Từ 01/6/2008 – 01/7/2009

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Nội dung nghiên cứu

3.2.1.1 Thí nghiệm 1

Ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn

Agrobacterium tumefasciens.

Công thức Nguồn mẫu cấy Ghi chú 1 ðối chứng (không lây nhiễm

với vi khuẩn)callus, vảy củ, ñỉnh chồi 2 Vảy củ

3 Callus

4 Protocorm

TNC: 3 ngày, ðNC: 3 ngày Lây nhiễm: ngâm trong dịch vi khuẩn 5 phút, ñồng nuôi cấy Lượng mẫu: 450 mẫu/công thức

Từ kết quả thí nghiệm trên rút ra công thức tốt nhất làm thí nghiệm tiếp theo.

3.2.1.2 Thí nghiệm 2

Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens.

Công thức Thời gian tiền nuôi cấy (ngày) Ghi chú 1 ðC (không nhiễm khuẩn)

2 0 3 1 4 3 5 5 6 7 Nguồn mẫu: loại mẫu tốt nhất từ thí nghiệm 1

Lây nhiễm: ngâm trong dịch vi khuẩn 5 phút, ñồng nuôi cấy

Lượng mẫu: 450 mẫu/công thức

ðNC: 5 ngày

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………33

3.2.1.3 Thí nghiệm 3

Ảnh hưởng của phương pháp cắt và lây nhiễm mẫu ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

- Cách 1. Mẫu cấy ñược cắt trên giấy khô sau ñó ngâm vào dung dịch vi khuẩn trong thời gian 5 phút sau ñó vớt ra, ñể khô trên giấy thấm vô trùng.