* Chiết tách DNA tổng số từ mẫu mô thực vật
Có 2 phương pháp chiết DNA: - Phương pháp 1:
DNA tổng số từ mô lá ñược chiết nhanh bằng kiềm (NaOH) theo phương pháp của Wang et al. (1993) như sau:
Bước 1: Cho khoảng 50 mg mô lá vào tube 1,5 ml; tiếp tục cho 0,5 ml dung dịch NaOH 0,5M vào tube. Dùng chày nhựa nghiền nhuyễn mẫu lá.
Bước 2: Hòa loãng dịch nghiền 50 lần với ñệm Tris 0,1M; pH 8 (5µl dịch nghiền hòa loãng với 245 µl ñệm Tris).
Bước 3: Lưu trữ mẫu trong tủ lạnh – 20oC - Phương pháp 2:
Chiết tách DNA tổng số bằng CTAB Bước 1:
+ Cho 0,1g mô lá tươi hoặc 0,02g mô lá khô vào tube 1,5ml
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………23
Dùng chày nhựa nghiền nhuyễn.
+ Ủ 10 phút ở 65oC sau ñó ñể nguội ở nhiệt ñộ phòng Bước 2:
+ Cho 0,5 ml hỗn hợp (Chlorofom : isoamyl alcohol = 24 : 1) vào tube lắc ñều.
+ Sau ñó ly tâm 12.000/phút trong 10 phút; hút dịch trên của tủa sang một tube mới (0,35ml).
Bước 3:
+ Cho tiếp thể tích tương ñương 0,35 ml hỗn hợp (Chlorofom : isoamyl alcohol = 24 : 1) vào tube lắc ñều
+ Ly tâm 10 phút, hút dịch trên của phần kết tủa san một tube mới (0,25 ml)
Bước 4:
+ Cho một thể tích tương ñương Propanol vào tube, lắc ñều, ñể lạnh -20oC trong 10 phút
+ Ly tâm 10 phút, hút bỏ dịch trên, giữ lại cặn (DNA). Bước 5, 6:
+ Rửa cặn hai lần Ethanol 70o (0,7 ml/lần), ñảo nhẹ, ñổ hết Etol. Sau ñó spin và dùng pipet hút hết ethanol thừa
Bước 7:
+ ðể khô cạn trong không khí ít nhất 30 phút Bước 8:
+ Hòa cặn trong 0,1 ml nước cất 2 lần và giữở -20oC
* Tiến hành phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) và ñiện di sản phẩm PCR
- Chu trình phản ứng PCR
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………24 H2O : 18,75µl Buffer : 2,5µl dNTPs : 0,5µl Mồi F : 0,5µl Mồi R : 0,5µl MgCl2 : 1,5µl Taq (Fermantas): 0,25µl DNA : 0,5µl Tổng thể tích : 25µl + Quy trình thực hiện phản ứng PCR 94oC 5 phút x 1 94 oC 50 oC 72 oC 30 giây 35 giây 1 phút 35 giây x 35 72 oC 5 phút x 1 - ðiện di sản phẩm PCR
+ Sản phẩm PCR ñược ñiện di trên gel agarose 1% ñược chuẩn bị bằng ñệm TAE và chứa 0,5 mg/ml Ethidium bromide.
+ Gel ñược chạy trên thiết bị ñiện di là Mini-Sub Cell (Biorad) với ñệm TAE ở ñiện thế 110V trong 30 – 40 phút.
+ Bản gel ñược kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và ñược chụp lại bằng máy ảnh kỹ thuật số.
3.3.4. Xác ñịnh tính gây bệnh của TYLCVBV trên cà chua bằng kỹ thuật lây nhiễm Agroiculation và lây nhiễm bằng bọ phấn