* Phương pháp Agroiculation:
- Có 3 kỹ thuật agroinoculation chính là: + Thấm chân không
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………25
+ Tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô + Tưới trực tiếp dịch vi khuẩn vào ñất.
Chúng tôi sử dụng kỹ thuật tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mô:
- Bước 1: Nuôi cây dòng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm trong 200ml môi trường LB lỏng chứa 3 loại kháng sinh (streptomicin 200µg/ml, refampicin 34µg/ml và kanamicin 100µg/ml) trong tủ nuôi cấy có lắc (250rpm/28oC/2ngày).
- Bước 2: Ly tâm dịch vi khuẩn (3000g/ 5 phút)
- Bước 3: Hòa cặn vi khuẩn với 5 ml môi trường LB chứa 3 loại kháng sinh trên.
- Bước 4: Dùng kim tiêm tiêm dịch vi khuẩn vào chồi và 4 nách lá tiếp theo, mỗi vị trí tiêm 10µl.
- ðể ñảm bảo cây không bị lây nhiễm bọ phấn, thí nghiệm ñược thực hiện tại nhà lưới trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới.
Chuẩn bị tế bào E. coli tiềm năng 1. Chuẩn bị môi trường
- Môi trường LB lỏng 1 l 250 ml Trypton 10 g 2.5 g Yest extract 5 g 1.25 g NaCl 5 g 1.25 g Agar 15 g 3.75 g
Cho các thành phần vào. Lên thể tích. Lắc cho tan. Hấp ở 121 oC/ 15 phút.
(môi trường LB có thể là lỏng (không có agar) hoặc ñặc (có agar), ñể rót ra ñĩa Petri.
Nếu bổ xung kháng sinh thì phải ñể môi trường nguội khoảng 55 oC.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………26
Trình tự
1. Lấy 1 tube XL1 blue (giữ trong tủ - 80o). ðể trên khay ñá khoảng 15 – 30 phút cho tan ñông.
2. Dùng que cấy vi khuẩn, cấy vi khuẩn lên môi trường LB ñặc (không chứa kháng sinh). Ủ qua ñêm ở 37oC.
3. Cấy ñộ 4-5 khuẩn lạc XL1 blue vào tube chứa 5 mL LB lỏng chứa Tetracillin. Ủ tube qua ñêm ở 37oC có lắc (phòng TN JICA).
4. Cho tất cả 5 ml dịch XL1 blue trên vào bình cỡ 500 ml chứa 200 ml SOB. Ủ bình ở 18°C với lắc mạnh 200 – 250 rpm cho tới khi OD600 = 0.6
5. Ly tâm dịch vi khuẩn ở 2500 g/ 4oC/10 phút. Loại dich trên tủa. Giữ lại cặn vi khuẩn.
6. Cho vào trong tube ly tâm chứa cặn vi khuẩn 80 ml TB lạnh. Hòa tan vi khuẩn.
7. Ly tâm giống bước 5. Loại bỏ dịch trên tủa, giữ lại cặn. 8. Cho tiếp 80 ml TB lạnh và lặp lại giống bước 6 và 7. 9. Hòa cặn vi khuẩn với 20 ml TB lạnh.
10. Bổ sung DMSO tới nồng ñộ 7% (9.3 ml dịch TB/vi khuẩn + 0.7 ml DMSO). 11. Cho 150 µl dịch competent cells vào tube 0.5 ml. Giữ các tube ở - 80oC
* Phương pháp lây nhiễm bằng bọ phấn
Bọ phấn ñược thả trên cây nguồn bệnh cho chúng chích hút một ngày sau ñó chuyển sang cây khỏe ñược trồng trong nhà lưới dùng ñể lây nhiễm, mỗi loại gồm 10 cây, mỗi cây ñặt trong một hộp. Ở mỗi hộp thả 10 con bọ phấn cho chúng truyền virus một ngày sau ñó ñưa ra khỏi hộp.
* Chỉ tiêu theo dõi:
+ Quan sát mô tả triệu chứng.
+ Tỷ lệ nhiễm bệnh tính cho mỗi loại cây:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………27
Số cây biểu hiện triệu chứng TLCNB (%) = ————————————
Số cây lây bệnh
+ Thời kì tiềm dục (TKTD): tính từ lúc lây nhiễm cho tới khi cây biểu hiện triệu chứng (ngày).