- Sai số chuẩn của giá trị trung bình (SE) (Std.error of the mean)
2. Kết quả phân lập vi khuẩn
Bảng 4.1: Kết quả phản ứng sinh hoá của VK đã phân lập của cá Bống bớp trên kít API 20Ẹ
Các loài vi khuẩn đã phân lập Kết quả Chỉ tiêu Vibrio cholerae Vibrio alginolyticus Vibrio parahaemolyticus Aeromonas hydrophila Màu KL/TCBS Vàng Vàng Xanh Vàng Nhuộm gram - - - - Hỡnh dạng VK TK TK TK TK ONPG + - - + ADH - - - + LDC + + + - ODC + + + - CIT + + + V H2S - - - - URE - - - - TDA - - - - IND + + + + VP + - - + GEL + + + + GLU + + + + MAN + + + + INO - - - -
SOR - - - - RHA - - - + SAC + + - + MEL - - - - AMY - - - + ARA - - + + OF +/ + +/ + +/ + + OX + + + + NO2 + + + +
Bảng 4.2: Thành phần loài vi khuẩn trên cá Bống bớp bị bệnh.
Dấu hiệu phồng rộp (17 mẫu)
Dấu hiệu lở loét (10 mẫu) TT Loài vi khuẩn Tần số nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) Tần số Tỷ lệ nhiễm (%) Tần số Tỷ lệ nhiễm (%) 1 V. cholerae 5/27 18,51 5/17 29,41 0 0 2 V. alginolyticus 11/27 40,74 11/17 64,70 0 0 3 V. parahaemolyticus 9/27 33,33 0 0 9/10 90 4 Ạ hydrophila 4/27 14,81 4/17 25,52 0 0 5 Streptococcus sp 8/27 29,63 0 0 8/10 80
Cá Bống bớp có dấu hiệu bị bệnh phồng rộp tiến hành phân lập đ−ợc 3 chủng vi khuẩn: Ạ hydrophyla, V. cholerae và V. alginolyticus
Cá Bống bớp có dấu hiệu bị bệnh lở loét tiến hành phân lập đ−ợc 2 loài vi khuẩn là Streptococcus sp và V. parahaemolyticus.
Vi khuẩn V. alginolyticus thu đ−ợc trên tổng số mẫu cá bị bệnh (11/27 mẫu) cao nhất sau đó đến V. parahaemolyticus (9/27mẫu), còn vi khuẩn Ạ hidrophila thu đ−ợc là thấp nhất (4/27mẫu). Điều này cũng phù hợp với kết quả của Trần Văn Đan và ctv rằng ở giai đoạn cá Bống bớp h−ơng, giống và cá bố mẹ chỉ tìm thấy vi khuẩn
V. parahaemolyticus, V. alginolyticus và một số vi khuẩn Pseudomonas spp là tác
mới chỉ xuất hiện hiện t−ợng cá bỏ ăn, bơi lờ đờ và hiện t−ợng chết do bệnh trắng đuôi chứ ch−a có cá bị bệnh phồng rộp và lở loét [18]. Đối với bệnh phồng rộp trong 3 tác nhân gây bệnh V. alginolyticus, V. cholerae, Ạ hidrophila thì tác nhân gây
bệnh là vi khuẩn V. alginolyticus có tần số bắt gặp cao nhất (11/17 mẫu). Bệnh lở loét cả 2 tác nhân gây bệnh V.parahaemolyticus, Streptococcus sp đều có tần số bắt gặp cao gần nh− nhaụ
Dựa vào kết quả thử kít API 20E ở bảng 4.1 ta thấy V. cholerae và V.
alginolyticus chỉ khác nhau 2 phản ứng là ONPG và VP, V. cholerae phản ứng
d−ơng tính với ONPG và VP còn V. alginolyticus lại phản ứng âm tính với ONPG và OF.
Vi khuẩn V. alginolyticus và V. parahaemolyticus cũng chỉ khác nhau 2 phản ứng là V. alginolyticus lên men đ−ờng Sacrose nh−ng không lên men đ−ờng Arabinose còn V. parahaemolyticus ng−ợc lại không lên men đ−ờng Sacrose mà lên men đ−ờng Arabinosẹ Tuy nhiên chúng có đặc điểm rất khác biệt là trên TCBS thì khuẩn lạc của V. alginolyticus màu vàng còn khuẩn lạc của V. parahaemolyticus màu xanh.
Đối với V. cholerae và V. parahaemolyticus khác nhau rất nhiềụ V. cholerae
phản ứng d−ơng tính với ONPG, VP, và lên men đ−ờng Sacrose, không lên men đ−ờng Arabinose còn V. parahaemolyticus phản ứng âm tính với ONPG, VP và không lên men đ−ờng Sacrose, lên men đ−ờng Arabinosẹ Đặc biệt V. cholerae có khuẩn lạc màu vàng trên TCBS còn V. parahaemolyticus có khuẩn lạc màu xanh.
Xác định vi khuẩn V. cholerae: Khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi tr−ờng TCBS ủ trong tủ ấm nhiệt độ 30oC sau 24 giờ thấy mọc khuẩn lạc mầu vàng, tròn, rìa nhẵn, lồi, đ−ờng kính khuẩn lạc từ 2 - 2,5mm (hình 4.4). Nhuộm gram soi trên kính hiển vi bằng vật kính dầu (x100) thấy vi khuẩn là trực khuẩn bắt màu hồng của thuốc nhuộm (hình 4.5). Thử phản ứng OF thì lên men, Cytochrom oxydase d−ơng tính, H2S âm tính điều này khẳng định vi khuẩn này thuộc nhóm Vibrio.
Hình 4.4: Khuẩn lạc của V. cholerae trên môi tr−ờng TCBS.
Hình 4.5: Hình dạng vi khuẩn V. cholerae khi nhuộm gram.
Dựa trên kít thử API 20E so màu đọc kết quả vi khuẩn có các phản ứng d−ơng tính nh− ONPG, LDC, ODC, CIT, IND, VP, GEL, GLU, MAN, và SAC, các phản ứng ADH, URE, TDA, INO, SOR, RHA, MEL, AMY và ARA âm tính (hình 4.6). Tra theo bảng của Nicky B. Buller (2004) thấy các phản ứng của vi khuẩn trên chính là các phản ứng của vi khuẩn V. choleraẹ Ch−a có nghiên cứu nào về vi khuẩn V.
cholerae gây bệnh cho cá Bống bớp. Tuy nhiên đối với cá biển ở Việt Nam theo Bùi
Quang Tề và ctv, 1998 thì V. cholerae đã là một trong những tác nhân gây bệnh cho cá Song từ với tỷ lệ xuất hiện là 3,85% [3]. Theo Phan Thị Vân và ctv (2005) thì V.
cholerae xuất hiện với tỷ lệ là 20% [11]. Theo Leong (1994), tại Singapore khi cá có
dấu hiệu lở loét đồng thời xuất huyết nội tạng, phân lập đ−ợc 4 chủng vi khuẩn
Vibrio trong đó có V. cholerae. Điều này giúp tôi khẳng định rằng vi khuẩn đã phân
lập là vi khuẩn V. cholerae [39].
Xác định vi khuẩn Vibrio alginolyticus: Trên môi tr−ờng TCBS khuẩn lạc có màu vàng, tròn, lồi và rìa nhẵn (hình 4.7). Kích th−ớc khuẩn lạc từ 3 - 3,5mm. Tiến hành nhuộm gram và quan sát trên kính hiển ở vật kính x100 có soi dầu thấy vi khuẩn là trực khuẩn bắt màu hồng của thuốc nhuộm (hình 4.8). Thử phản ứng OF thì lên men, Cytochrom oxydase d−ơng tính, H2S âm tính điều này khẳng định vi khuẩn này thuộc nhóm Vibriọ Dựa trên kít thử API 20E so màu đọc kết quả vi khuẩn có các phản ứng d−ơng tính nh−, LDC, ODC, CIT, IND, GEL, GLU, MAN, và SAC, các phản ứng ONPG, ADH, URE, TDA, VP, INO, SOR, RHA, MEL, AMY và ARA âm tính (hình 4.9). Tra theo bảng của Nicky B. Buller (2004) thấy các phản ứng của vi khuẩn trên là các phản ứng của vi khuẩn V. alginolyticus [46].
Năm 2006, đã tìm thấy tác nhân cơ hội là vi khuẩn V. alginolyticus trên cá Bống bớp giai đoạn cá h−ơng, giống và cá bố mẹ [13]. Đối với cá biển thì tác nhân là vi khuẩn V. alginolyticus không còn xa lạ. Theo báo cáo kết quả của đề tài '' Chuẩn đoán và phòng trị một số bệnh vi khuẩn, virus ở cá nuôi lồng và thuỷ đặc sản'' năm 1996-1998 của Bùi Quang Tề và ctv thì vi khuẩn V. alginolyticus là một trong những tác nhân gây bệnh xuất huyết, lở loét trên cá Song nuôi lồng với tỷ lệ 44,23%.
Hình 4.7: Khuẩn lạc V. alginolyticus trên môi tr−ờng TCBS.
Hình 4.8: Hình dạng vi khuẩn V. alginolyticus khi nhuộm gram.
Theo Arthur và Ogawa trên cá Song nuôi ở Nam Châu á khi thấy cá Song chấm cam xuất hiện vết loét, da xuất huyết bóng hơi phình to và gan xuất huyết cũng phân lập đ−ợc vi khuẩn V. alginolyticus. Theo Ong (1998), cá Song nuôi có dấu hiệu da bị phồng rộp phân lặp thấy sự có mặt của vi khuẩn V. alginolyticus.
Xác định vi khuẩn V. parahaemolyticus: Giống nh− V. chorelae và V. alginolyticus, V. parahaemolyticus cũng phát triển trên môi tr−ờng TCBS ở nhiệt độ 30o C, sau 24 giờ khuẩn lạc xuất hiện tuy nhiên không phải là khuẩn lạc màu vàng mà là khuẩn lạc mầu xanh, có đ−ờng kính từ 3-4mm, tròn, lồi, nhẵn (hình 4.10). Nhuộm gram bắt mầu gram âm, có dạng trực khuẩn (hình 4.11). Thử phản ứng OF thì lên men, Cytochrom oxydase d−ơng tính, H2S âm tính điều này khẳng định vi khuẩn này thuộc nhóm Vibriọ Dựa trên kít thử API 20E so màu đọc kết quả vi khuẩn có các phản ứng d−ơng tính nh−, LDC, ODC, CIT, IND, GEL, GLU, MAN, và ARA, các phản ứng ONPG, ADH, URE, TDA, VP, INO, SOR, RHA,SAC, MEL, AMY âm tính (hình 4.12). Tra theo bảng của Nicky B. Buller (2004) thấy các phản ứng của vi khuẩn trên là các phản ứng của vi khuẩn V. parahaemolyticus.
Theo đề tài "Nghiên cứu thực nghiệm hoàn thiện công nghệ sản xuất giống cá bớp Bostrichthy sinensis ở Hải phòng" của Trần Văn Đan và ctv năm 2006 đã phân lập đ−ợc loài vi khuẩn V. parahaemolyticus trên cá Bống bớp ở giai đoạn cá h−ơng, cá giống và cá bố mẹ [18].Theo Chinabut, S. (1996) khi trên thân cá Song điểm gai da có dấu hiệu phồng rộp tiến hành phân lập đ−ợc vi khuẩn V. parahaemolyticus.
Hình 4.10: Khuẩn lạc V. parahaemolyticus trên môi tr−ờng TCBS.
Hình 4.11 : Hình thái vi khuẩn V. parahaemolyticus khi nhuộm gram.
Xác định vi khuẩn Aeromonas hydrophila:
Hình 4.13: Khuẩn lạc Aeromonas hydrophila trên môi tr−ờng NẠ
Hình 4.14: Hình thái vi khuẩn Ạ hydrophila khi nhuộm gram.
Trên môi tr−ờng Nutrien Agar ở nhiệt độ 30o C khuẩn lạc của vi khuẩn có mầu trắng sữa, lồi, rìa nhẵn, kích th−ớc 2,5-3mm (hình 4.13). Khi chuyển sang môi tr−ờng TCBS ủ ở nhiệt độ 30o C sau 24 giờ thì mọc khuẩn lạc màu vàng, đ−ờng kính khuẩn lạc 1mm. Nhuộm gram vi khuẩn bắt màu gram âm, hình dạng tế bào là trực khuẩn (hình 4.14). Thử Catalase cho kết quả d−ơng tính, thử OF cho kết quả d−ơng tính. Tiến hành thử các phản ứng sinh hoá trên kit API 20E cho kết quả ONPG, ADH, IND, VP, GEL, GLU, MAN, RHA, SAC, AMY, ARA d−ơng tính, các phản ứng còn lại là âm tính (hình 4.15). So sánh với bảng tra kết quả của kit API 20E thấy trùng khớp với vi khuẩn Aeromonas hydrophilạ
Ch−a có nghiên cứu cụ thể nào về vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá Bống bớp, nh−ng đối với cá Song thì Aeromonas sp đã xuất hiện tại Vũng Tầu (Phan Thị Vân, 2005). Theo Chinabut (1996), Aeromonas sp đã gây bệnh trên cá Song nuôi lồng ở Thái Lan [29].
Xác định vi khuẩn Streptococcus sp: Mẫu cá bị bệnh lở loét, tiến hành cấy mẫu vi khuẩn trên môi tr−ờng Nutrien Agar ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC sau 24 giờ thấy xuất hiện khuẩn lạc, màu trắng có đ−ờng kính 1.5 - 2 mm. Khi nhuộm gram thấy vi khuẩn nhuộm bắt màu xanh tím, soi trên kính hiển vi với vật kính x100 có soi dầu thấy hình dạng vi khuẩn là hình cầu, chúng liên kết với nhau tạo thành chuỗi (hình 4.16). Nếu nh− dựa vào mô tả của Austin (1987) về vi khuẩn Streptococcus sp rằng Streptococcus sp phát triển trên môi tr−ờng Nutrien Agar, ở nhiệt độ 22-370C, đ−ờng kính khuẩn lạc 1 - 2mm, tế bào hình cầu kết lối lại thành chuỗi (quan sát ở kính hiển vi với vật kính 100x có dùng dầu) [21], có thể khẳng định đ−ợc vi khuẩn đã thu trên cá Bống bớp bị bệnh lở loét là Streptococcus sp giống nh− mô tả của Austin.
Tuy nhiên cần phải phân biệt Streptococcus sp với Staphylococcus sp vì chúng có hình dạng tế bào giống nhau, cùng phát triển trên môi tr−ờng Nutrien Agar, cùng là vi khuẩn gram d−ơng, bắt màu xanh tím với thuốc nhuộm, cùng liên kết các tế bào với nhau để thành chuỗi, đối với Staphylococcus sp cũng có thể thành khối không nhất định. Chúng có điểm khác nhau cơ bản là Staphylococcus sp phản ứng
d−ơng tính với Catalase, còn Streptococcus sp phản ứng âm tính với Catalasẹ Bởi vậy phải tiến hành thử Catalase với vi khuẩn thu đ−ợc và thấy vi khuẩn thu đ−ợc phản ứng âm tính với Catalasẹ Mặc dù ch−a có nghiên cứu nào về Streptococcus sp trên cá Bống bớp nh−ng đối với cá biển theo Baliao (1998) cá Song cá Giò thì
Streptococcus sp là tác nhân cuối cùng gây chết cá Song cá Giò [22] điều này giúp
tôi khẳng định vi khuẩn thu đ−ợc là Streptococcus sp.
Hình 4.16: Hình thái vi khuẩn Streptococcus sp khi nhuộm gram.
Tóm lại: Tôi đã tiến hành thu mẫu và phân lập đ−ợc 5 loài vi khuẩn nghi ngờ gây bệnh lở loét và phồng rộp cho cá Bống bớp trong giai đoạn nuôi th−ơng phẩm tại Nghĩa H−ng - Nam Định là Aeromonas hydrophyla, Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus và Streptococcus sp. Mặc dù mới chỉ có rất
ít thông báo đã xác định đ−ợc vi khuẩn Vibrio alginolyticus, Vibrio
parahaemolyticus có trên cá Bống bớp giai đoạn cá h−ơng, cá giống và cá bố mẹ của Trần Văn Đan, nh−ng đã có rất nhiều thông báo về Ạ hydrophyla, Vibrio cholerae, Streptococcus sp trên cá biển của nhiều tác giả.