- Viện Nghiên cứu NTTS 1 - Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh
2. Ph−ơng pháp nghiên cứu
2.1. Thu mẫu
Khi thu mẫu thấy mẫu có dấu hiệu bệnh lý đ−a nhanh về phòng thí nghiệm để xử lý. Mẫu bệnh nặng không đem về đ−ợc thì chụp ảnh, mổ và cấy mẫu vi khuẩn ngay tại hiện tr−ờng.
Phân lập theo phương pháp nghiên cứu vi khuẩn ở cá và động vật thuỷ sản của Millar và Frerichs. (1993)
2.2. Xử lý mẫu trong phòng thí nghiệm
Sau khi mẫu cá bệnh đ−ợc đ−a về phòng tiến hành xử lý ngay:
- Quan sát những biểu hiện bệnh lý bên ngoài rồi ghi chép những biểu hiện không bình th−ờng trên cá mẫu và chụp ảnh.
- Đo chiều dài, trọng l−ợng mẫụ
-Dùng cồn 70 độ để sát trùng những chỗ cần mổ. - Dùng các dụng cụ vô trùng để giải phẫu cá.
- Lấy que cấy hơ đỏ trên ngọn lửa đèn cồn để lấy mẫu bệnh phẩm trên gan, thận cá bị bệnh cấy vào môi tr−ờng n−ớc tăng sinh Nutrient Borth (NB) + 1,5%NaCl hoặc trên môi tr−ờng cơ bản Nutrient Agar (NA) + 1,5% NaCl
2.3. Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Dựa vào phương phỏp nghiờn cứu vi khuẩn ở cỏ và động vật thuỷ sản của Millar và Frerichs (1993)
Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu phân lập vi khuẩn.
* Cấy vi khuẩn:
- Cấy chọn khuẩn lạc: phương phỏp thường dựng là cấy ria, mục đớch là làm cho khuẩn lạc đứng riờng rẽ. Ta tiến hành đốt núng đỏ que cấy sau mỗi vựng cấy để làm cho mật độ vi khuẩn giảm dần, mỗi tế bào vi khuẩn đứng riờng rẽ sẽ phỏt triển thành một khuẩn lạc sau thời gian nuụi cấỵ
Đường cấy vi khuẩn trờn đĩa lồng
Mẫu cỏ bệnh Thu mẫu bệnh phẩm Thử cỏc phản ứng sinh hoỏ Nuụi cấy, phõn lập Hỡnh thỏi
khuẩn lạc Nhuộm gram
Phõn loại vi khuẩn
(2
((4 (4
Nuụi vi khuẩn: Mẫu bệnh phẩm thu được nuụi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ
290C sau 24 - 48giờ kiểm tra hỡnh thỏi khuẩn lạc, chọn khuẩn lạc để cấy tiếp lờn mụi trường tăng sinh nhằm nhõn lượng vi khuẩn lờn. Sau 24 giờ nuụi cấy nhuộm gram, nếu được vi khuẩn thuần tiến hành thử cỏc phản ứng sinh hoỏ theo bộ kớt API 20E
* Nghiờn cứu hỡnh thỏi vi khuẩn:
Để nghiờn cứu hỡnh thỏi vi khuẩn, người ta sử dụng phương phỏp nhuộm Gram.
• Sau khi được giống vi khuẩn thuần, lấy mẫu phết lờn lam, cho thờm 1 đến 2 giọt nước muối sinh lý vụ trựng, dựng đầu que cấy dàn mỏng lờn lam kớnh.
• Để mẫu tự khụ ở nhiệt độ trong phũng.
• Hơ cao lam kớnh cú mẫu trờn ngọn lửa đốn cồn, để cốđịnh và diệt vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Nhỏ tiếp dung dịch 1 (tớm tinh thể) lờn tiờu bản, để yờn 30-60 giõỵ
• Rửa nước nhanh, vẩy khụ.
• Nhỏ dung dịch 2 (Lugol) để cốđịnh trong 1 phỳt (tiờu bản cú màu đen).
• Rửa nước nhanh, vẩy khụ.
• Nhỏ dung dịch 3 (Cồn Aceton) để nghiờng đầu một bờn lam để cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn, nhằm tẩy màụ
• Rửa nước nhanh, vẩy khụ.
• Nhỏ dung dịch 4 (Safranin) để cốđịnh 1 đến 2 phỳt.
• Rửa nước, để khụ hoặc dựng giấy thấm khụ, khụng được để xước mẫụ
• Soi dưới kớnh hiển vi bằng vật kớnh dầu (độ phúng đại x1000).
Dưới kớnh hiển vi ta cú thể xỏc định được vi khuẩn gram õm bắt màu hồng và gram dương bắt màu xanh tớm. Khi được vi khuẩn thuần tiến hành nuụi vi khuẩn trong mụi trường lỏng trypton, để cú dung dịch ở dạng huyền phự thử phản ứng sinh hoỏ.
* Thử phản ứng sinh hoỏ bằng bộ kớt API 20E
- Nguyờn lý
Phương phỏp này dựng 21 tiờu chuẩn thử sinh húa cho phộp định tờn một số loài vi khuẩn hỡnh que, gram õm và thuộc họEnterobacteriaceae.
Kớt thử API 20E gồm cú cỏc ống nghiệm nhỏ (microtube) trong cú chứa cỏc chất nền đó khử nước. Trong quỏ trỡnh ủ, hoạt động của vi khuẩn sẽ làm chuyển màu hoặc làm đục mụi trường. Sau 24h đọc cỏc phản ứng đối chiếu theo bảng kết quảđể định tờn.