3. Đối t−ợng, địa điểm, nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.5.3.Ph−ơng pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.5.3.1. Ph−ơng pháp phân lập và nuôi cấy nấm trên môi tr−ờng nhân tạo
Mẫu bệnh đ−ợc rửa sạch đất cát bằng n−ớc máỵ Sau khi rửa sạch mẫu bệnh có thể nhìn thấy rõ triệu chứng điển hình của bệnh. Cắt những mẫu bệnh thành những miếng nhỏ dài khoảng 1cm (gồm cả phần khỏe và phần bị bệnh). Sau đó nhúng các mẫu cắt đó vào dung dịch cồn 70 độ để khử trùng bề mặt
trong vòng 30 giâỵ Tiếp đó rửa lại bằng n−ớc cất vô trùng rồi thấm khô bằng giấy lọc vô trùng. Cắt thành những mẫu nhỏ có phần mô bệnh và mô khỏe, cấy những mẫu này vào môi tr−ờng WẠ Sau khi phân lập, để các đĩa trong phòng nuôi cấy d−ới điều kiện ánh sáng 12 giờ chiếu sáng trong ngày và nhiệt độ khoảng 25-300C. Sau khi tản nấm mọc tiến hành cắt đầu sợi nấm cấy chuyển sang môi tr−ờng PGA để quan sát các đặc điểm của nấm gây bệnh. Môi tr−ờng cấy truyền cũng đ−ợc để d−ới điều kiện ánh sáng và nhiệt độ thích hợp. Toàn bộ việc phân lập đ−ợc tiến hành trong điều kiện vô trùng và cách ly trong tủ cấỵ
3.5.3.2. Ph−ơng pháp kiểm tra, giám định các loại nấm gây bệnh d−ới kính hiển vi
Các mẫu bệnh có triệu chứng điển hình còn t−ơi mới đem về phòng thí nghiệm đ−ợc quan sát bằng ph−ơng pháp để ẩm và kiểm tra d−ới kính hiển vị Một số nấm đ−ợc phân ly, nuôi cấy để tạo nấm thuần (lsolate), lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch, chúng tôi tiến hành giám định bệnh theo các tài liệu giám định của Talbot P.H.B, Ph.D (1971) [62] tài liệu của Kendrick, W.B (1971) [44], Barnet H.L và Barry B. Hunter (1998) [32].
3.5.3.3. Ph−ơng pháp lây bệnh nhân tạo trong chậu vại với bệnh đốm đen lá hoa cúc (Septoria chrysanthemi)
Thí nghiệm tiến hành với 3 công thức: + Công thức 1: Có sát th−ơng
+ Công thức 2: Không sát th−ơng
+ Công thức 3: Đối chứng (lây bệnh bằng n−ớc cất)
Thí nghiệm trên các giống cúc vàng chanh Đà Lạt, cúc trắng Nhật CN93, cúc tím hè Đà Lạt. Mỗi công thức gồm 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại gồm 5 cây, mỗi cây 3 lá (tổng cộng 15 lá).
Chỉ tiêu theo dõi: Ngày lây bệnh, ngày phát bệnh, tính thời kỳ tiềm dục (ngày), số lá lây, số lá phát, tính tỷ lệ bệnh (%).
3.5.3.4. Nghiên cứu khả năng nảy mầm của bào tử nấm đốm đen lá hoa cúc (Septoria chrysanthemi) ở các ng−ỡng nhiệt độ khác nhau (15, 20, 25, 30,
350C) bằng ph−ơng pháp lam lõm
Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tỷ lệ nảy mầm của bào tử (%) sau 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ. (Thí nghiệm gồm 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là một lam kính).
3.5.3.5. Nghiên cứu khả năng nảy mầm của bào tử nấm đốm đen lá hoa cúc (Septoria chrysanthemi) ở các mức pH khác nhau (4, 5, 6, 7, 8)
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ nảy mầm của bào tử (%) sau 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ. (Thí nghiệm gồm 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là một lam kính).
3.5.3.6. Tìm hiểu ảnh h−ởng của một số thuốc hóa học ở các nồng độ khác nhau đến sự nảy mầm của bào tử nấm đốm đen lá hoa cúc (Septoria chrysanthemi)
Thí nghiệm tiến hành có 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là một lam kính. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ nảy mầm của bào tử (%) sau 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ.
3.5.3.7. Khảo sát hiệu lực của một số thuốc trừ nấm đối với một số nấm gây bệnh hoa cúc trong phòng thí nghiệm theo ph−ơng pháp của Uesugi Yasuhiko
Môi tr−ờng thử thuốc: Cân thuốc theo l−ợng đ4 tính phù hợp với nồng độ cần pha, để thuốc vào trong bình tam giác hay ống đong có định mức, đổ n−ớc cất vô trùng theo l−ợng cần để tạo dung dịch mẹ có nồng độ xác định.
Thí nghiệm đ−ợc tiến hành gồm 4 công thức:
+ Công thức 1: Score 250 ND nồng độ 200, 600, 800 ppm + Công thức 2: Topsin M 70 WP nồng độ 200, 600, 800 ppm
+ Công thức 3: Anvil 5 SC nồng độ 200, 600, 800 ppm + Công thức 4: Daconil 75 WP nồng độ 200, 600, 800 ppm
+ Công thức 5: Đối chứng (môi tr−ờng PGA không sử dụng thuốc) Mỗi ng−ỡng nồng độ có 3 lần nhắc lạị Mỗi lần nhắc lại một hộp petri Chỉ tiêu theo dõi: Đo đ−ờng kính tản nấm trung bình (mm) sau cấy từ 1- 5 ngàỵ
* Công thức pha chế dung dịch mẹ để thử thuốc trừ nấm trên môi tr−ờng nhân tạo PGA
+ Pha dung dịch mẹ: P (g) (WP) = / 6 100 10 a ai mlxbml x à Trong đó: 1 àg ai/ml = 1 ppm = 106 b ml : n−ớc cất vô trùng
+ Tính số l−ợng ml dung dịch mẹ cần lấy để cho vào từng loại môi tr−ờng trong hộp Petri ở nồng độ cần có: X ml = / / C gai ml xml M gai ml à à
Trong đó: C: Giá trị không đổi P (g) (WP) M àg ai/ml t−ơng ứng với a àg ai P (g) (WP) = bml
C