Mẫu nấm Colletotrichum spp. ựược nuôi trong môi trường PDA lỏng với 100 ml ựược ựựng trong lọ tam giác 250 ml ựể trong phòng thắ nghiệm nhiệt ựộ 25 Ờ 30oC. Sau 7 ngày thu sinh khối bằng máy hút chân không và giấy lọc khử trùng, sinh khối ựược rửa bằng nước cất khủ trùng từ 3 Ờ 4 lần ựể loại bỏ tạp chất thu ựược sợi nấm sạch và làm khô sợi nấm. Mẫu ựược cất giữ trong tủ lạnh sâu Ờ 20oC làm nguyên liệu tách chiết ADN tổng số.
2.4.2. Tách chiết ADN isolate Colletotrichum spp.
Dùng cối chày sứ và nitơ lỏng ựể nghiền các mẫu thành dạng bột mịn và cho vào ống eppendorf 2 ml cất vào tủ - 20o C.
Chúng tôi sử dụng quy trình tách chiết ADN tổng số của Aga et al.
(2003) gồm các bước sau [8]:
- Bước 1: Cân khoảng 300 mg mẫu nấm (ựã nghiền với nitơ lỏng thành dạng bột mịn) cho vào ống eppendorf 2ml.
- Bước 2: Bổ sung 750ộl Extraction buffer và 100ộl 10% SDS.
- Bước 3: Ủ ở nhiệt ựộ 65oC, thỉnh thoảng lắc nhẹ cho ựềụ
- Bước 4: Thêm 250 ộl 5M KAC, ly tâm 1000 vòng/ phút. Sau ựó ủ 30 phút trong ựá. Ly tâm các mẫu với tốc ựộ 14.000 vòng/phút trong 15 phút.
Số lá (quả) bị nhiễm bệnh
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
- Bước 5: Hút phần dịch nổi ở phắa trên ựược chuyển sang 2 ống eppendorf 1,5 ml mớị Bổ sung lượng thể tắch isopropanol lạnh bằng lượng lần thể tắch ban ựầu, lắc nhẹ và ủ trong -20oC trong 30 phút.
- Bước 6: Ly tâm các mẫu với tốc ựộ 14000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ phần nước ở trên, lấy phần tủa ở dướị
- Bước 7: Bổ sung 250 ộl 1xTE ựể hoà tan kết tủa ADN. Sau ựó bổ sung 250 ộl dung dịch ựệm CTAB. Lắc nhẹ.
- Bước 8: Ủ ở 65oC trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ.
- Bước 9: Bổ sung một lần thể tắch hỗn hợp Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (tỷ lệ 25: 24: 1 tương ứng theo thể tắch). Ly tâm với tốc ựộ 14.000 vòng/phút trong 5 phút. Hút phần dịch trên sang ống mớị Lặp lại bước 9. - Bước 10: Bổ sung một lần thể tắch isopropanol lạnh. Ủ trong -20oC trong 30 phút.
- Bước 11: Ly tâm với tốc ựộ 14.000 vòng/phút trong 15 phút. Bỏ phần dịch lấy phần kết tủa và ựể khô tủạ
- Bước 12: Sau khi tủa khô hoà tan ADN trong 100 ộl nước hoặc 1xTE, thêm 2,5 ộl 1mg/ml 30 phút trong tủ 37o C. Bất hoạt RNAse 10 mg bằng nhiệt ở 65oC trong 10-15 phút, sau ựó mẫu ADN tổng số ựược cất giữ phục vụ các thắ nghiệm tiếp theọ
Các mẫu ADN tổng số sau ựó sẽ ựược kiểm tra chất lượng bằng phương pháp ựiện di trong 1X TAE trên gel agarose 1% tại 110 V trong 30 phút. Sản phẩm sau ựó ựược ngâm trong ethidium bromide, rửa bằng nước soi trên máy Gel - Dox.
2.4.3. định lượng ADN bằng phương pháp ựo ựộ hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260/280nm
Xác ựịnh ựộ tinh sạch của mẫu ADN và ựo quang phổ hấp thụ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
định lượng bằng máy Nanodrop ND -1000 Spectrophotometer ở bước sóng 260/280nm. độ tinh sạch ựược xác ựịnh bằng tỉ số A260/A280 ựạt ựến 1.8- 2 thì có thể coi ADN ựã tách chiết ựủ ựộ sạch dùng cho các kỹ thuật sinh học phân tử tiếp theọ
2.4.4. Phản ứng PCR ựặc hiệu
để xác ựịnh một cách chắnh xác ựó có phải loài C.gloeosprioides chúng tôi tiến hành phản ứng ựặc hiệụ Từ các mẫu ADN tổng số thu ựược từ
Colletotrichum spp. Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi ITS4/CgInt kắch thước band 450bp ựúng là loài C.gloeospoides.
Phản ứng ựược thực hiện với thể tắch 20 ộl hỗn hợp chứa dung dịch ựệm PCR 10x (MgCl2), dNTP 2mM, ITS4 10mM, CgInt 10mM, 0,2 ộl Taq polymerase 5U/ ộl (Fermentas), 20 - 50 ng mẫu ADN [39].
Phản ứng ựược chạy bằng máy nhân gen Applied Biosystems 9700. Chu trình chạy PCR bao gồm bước dãn xoắn ở 94oC trong 4 phút, tiếp theo 34 chu kỳ tại nhiệt 94oC trong 1 phút, 58oC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút, kết thúc 72oC trong 7 phút. Sản phẩm PCR sau ựó ựược chạy trên agarose 1% trong bể ựiện di 1.0 X TAE, 110V, 30- 35 phút. Ngâm sản phẩm trong ethidium bromide 30 phút và tráng qua với nước. Soi dưới ựèn UV, chụp ảnh trên máy Canon EOS 40D.
2.4.5. Phản ứng RAPD Ờ PCR (Random Amplified Polymorphic ADN)
Phản ứng RAPD dựa vào nguyên tắc PCR sử dụng các ựoạn mồi có trình tự ngẫu nhiên nghiên cứu quan hệ di truyền Colletotrichum. spp. Sử dụng marker 1kb của Fermentas (GeneRuler Ỏ 1 kb DNA Thang, 250-10000 bp) Phản ứng PCR ựược thực hiện với thể tắch 20 ộl chứa dung dịch ựệm phản ứng 10X, 20 ng mẫu ADN , 100 ộM dNTP, 20 ng mồi, 0.2ộl 5U Taq Polymerase (Fermentas).
Chu trình chạy PCR: Bắt ựầu với 94oC trong 3 phút, sau ựó 45 chu kỳ bao gồm 94oC trong 1 phút, nhiệt ựộ gắn mồi 32oC trong 1 phút, 72o C trong 2
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
phút và kết thúc 7 phút 72oC. Sản phẩm chạy agarose 1,2 % trong bể ựiện di 1.0 X TAE, 110V, 30- 35 phút. Ngâm trong ethidium bromide 30 phút và rửa trong nước soi bằng máy Gel - Dox
Các băng ADN ựược ghi nhận sự có mặt hoặc vắng mặt của chúng trên gel, các băng xuất hiện ựược chấm là 1 và các băng không xuất hiện ựược chấm là 0. Các số liệu này ựược xử lý theo chương trình Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System computer program vesion 2.01 (NTSYS-pc2.01) (F.J Rohlf., 2000) ựể xác ựịnh hệ số tương ựồng di truyền và xây dựng cây quan hệ di truyền.
- Hệ số ựồng dạng di truyền có thể ựược tắnh theo công thức của M. Nei & Li (1979)
Trong ựó: Ni: số vạch của giống i Nij: số vạch chung của 2 giống i và j Nj: sốvạch của giống j Sij: Hệ số tương ựồng giữa i và j
2Nij Sij=
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
CHƯƠNG IIỊ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu bệnh thán thư
Các mẫu bệnh ựược thu thập tại các vườn nho thuộc huyện Ninh Sơn, tỉnh Ninh Thuận trong giai ựoạn bước vào thời kỳ thu hoạch, tháng 10 Ờ 11 năm 2010. Tổng số mẫu nho bị bệnh thu thập ựược gồm 95 mẫụ Dựa vào ựặc ựiểm triệu chứng trên các mẫu bệnh ựược chia làm hai nhóm (bảng 3.1).
Bảng 3.1: Số mẫu thu thập tại Ninh Sơn, Tỉnh Ninh Thuận
Giống Triệu chứng nhóm I Triệu chứng nhóm II
Cardinal 0 0 30 mẫu lá 10 mẫu quả
NH01-48 5 mẫu lá 15 mẫu quả 0 0
NH01-53 0 0 20 mẫu lá 5 mẫu quả
Không rõ tên giống 0 0 5 mẫu lá 5 mẫu quả
Tỷ lệ mẫu bệnh (%) 21 78.94
Trong ựó tỷ lệ mẫu bệnh nhóm II (78.94%) cao hơn tỷ lệ mẫu bệnh nhóm I (21%): mẫu bệnh thuộc nhóm I có triệu chứng ựiển hình trên lá xuất hiện nhiều chấm nhỏ, hình tròn, màu hơi ựỏ, vết ựốm sau ựó lan rộng, trở nên hõm xuống, gây nên vết thương ở giữa có màu xám, với mép xung quanh hình tròn. Mép vết bệnh màu nâu ựỏ tối ựến tắm ựen. Trên quả có những chấm màu ựỏ tròn. Các ựiểm chấm lớn dần ựường kắnh trung bình (2- 5 mm) và ăn lõm sâu vào quả có màu nâu ựỏ ựến ựen giống như mắt chim. Quả bị bệnh nặng không phát triển, tại vết bệnh nứt ra, cuống trái to xù ra có màu ựen (hình 3.1). Triệu chứng của mẫu bệnh chúng tôi thu thập ựược giống với những mô tả bệnh thán thư (ựốm mắt chim) của nhiều tác giả trong và ngoài nước [5,10].
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
Hình 3.1 : Triệu chứng nhóm I trên lá, quả cây nho
Ạ Triệu chứng bệnh trên lá; B, C.Triệu chứng bệnh trên quả
Từ 20 mẫu triệu chứng nhóm 1 chúng tối tiến hành phân lập các mẫu bệnh và tiến hành làm thuần . Từ những mẫu cấy trên môi trường PDA, sau 3- 4 ngày xuất hiện những khối nấm màu vàng, dai và hơi cứng. Khi soi dưới kắnh hiển vi chúng tôi phát hiện thấy rất nhiều bào tử. Sau khi chuyển sang môi trường PDA mới, chúng phát triển thành những khuẩn lạc màu vàng ựậm, thành khối có bề mặt gồ ghề gợn sóng với hệ sợi mềm ăn sâu vào bên trong môi trường,tốc ựộ phát triển rất chậm, sợi nấm ép chặt vào môi trường. Bào tử nấm soi dưới kắnh hiển vi có dạng ựơn bào, hình cầu trong suốt, kắch thước chiều dài/chiều rộng của bào tử 5.5- 6 x 2.3- 4ộm (hình 3.2). Sau khi làm thuần nấm bằng phương pháp cấy bào tử ựơn chúng tôi thu ựược 7 chủng nấm. đặc ựiểm hình thái khuẩn lạc và bào tử phù hợp với những nghiên cứu của nhiều tác giả Mai van Hao, Jamara khi mô tả loài Ẹampelina[5,25]. Do ựó bước ựầu chúng tôi có thể kết luận 7 isolate phân lập ựược thuộc loài
Elsinoe spp.
Hình 3.2 : Hình thái khuẩn lạc và bào tử Elsinoe spp.
Ạ khuẩn lạc; B. bào tử
A B C
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
Triệu chứng bệnh thuộc nhóm II có vết bệnh trên lá ban ựầu có những ựốm nhỏ như mũi kim màu nâu, sau ựó vết bệnh phát triển liên kết với nhau thành từng mảng và lan rộng ra thành vết bệnh lớn màu nâu, xung quanh viền nâu sậm vết bệnh trông như bị bỏng hoặc như bị cháy lá (hình 3.3A). Vết bệnh trên quả ban ựầu xuất hiện là những chấm nhỏ ly ti màu nâu nhạt trên vỏ quả sau chuyển sang màu nâu sẫm làm nứt vỏ quả có xuất hiện khối bào tử màu hồng trên bề mặt quả trông giống như vết bỏng, làm quả bị nứt và gây thối quả toàn bộ (hình 3.3B). Từ 75 mẫu bệnh nhóm 2 ựem phân lập và làm thuần chúng tôi thu ựược 33 mẫu nấm. đặc ựiểm triệu chứng bệnh của nhóm này giống như những mô tả về bệnh thán thư gây ra bởi nấm Colletotrichum củaMaiVănHào[5].
Hình 3.3: Triệu chứng nhóm II trên lá, quả cây nho
Ạ Triệu chứng trên lá B,C. Triệu chứng trên quả
đặc ựiểm hình thái khuẩn lạc của 33 mẫu nấm trên môi trường PDA rất ựa dạng về màu sắc, hình tháị Mép khuẩn lạc thường ựều, khuẩn lạc có thể xốp hoặc chắc, màu sắc khuẩn lạc có màu trắng tinh, trắng bẩn, xám ựến màu nâu (hình 3.4), hệ sợi nấm dài liên kết với nhau, sợi nấm ựa bào có vách ngăn ngang. Khối bào tử mọc thành từng cụm nhớt trên khuẩn lạc có màu hồng, cá hồi, hoặc vàng nhạt ựặc trưng của nấm Colletotrichum. Nhìn bằng
mắt thường khối bào tử nấm Colletotrichum rất dễ nhận biết. đặc ựiểm hình thái khuẩn lạc và bào tử phù hợp với những nghiên cứu của nhiều tác giả khi mô tả loài C. gloeosporioides [5,25,35].
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
Hình 3.4: Hình thái khuẩn lạc và bào tử Colletotrichum spp.
a; CL5 b;CQ3 c; NQ2 d;CQ26 e; NT3 h;NKQ
Hình 3.5: Hình thái bào tử Colletotrichum spp.
Ạ cuống sinh bào tử CL5 B. lông cứng(NQ2) C. bào tử nhóm 1 D.bào tử nhóm 2
a b c d e h D C B A
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
Bào tử nấm có hai dạng: Dạng 1 bào tử hình trụ thẳng, một ựầu tròn một ựầu hơi nhọn; dạng 2 có bào tử hình trụ thẳng 2 ựầu tròn chiếm phần lớn các isolate (hình 3.5C và D). Bào tử nấm trong suốt không có vách ngăn, kắch thước trung bình 13-18 ộm x 4.5 Ờ 6 ộm. Trên thực tế chúng tôi phát hiện ựược một số isolate có lông cứng (hình 3.5B). Quan sát cơ quan sinh sản sinh dưỡng hay còn gọi bào tử ựắnh dưới kắnh hiển vi bào tử ựược mọc ra từ cuống ựó là hình thức sinh sản vô tắnh.
đặc ựiểm hình thái học của 33 isolate Colletotrichum spp. ựược mô tả chi tiết ở bảng 3.2.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
Bảng 3.2: đặc ựiểm hình thái khuẩn lạc của các isolateColletotrichum spp.
Khuẩn lạc Sợi nấm Cơ quan sinh sản
Stt Isolate Màu sắc (a) Mép (b) Dạng (c) Mức ựộ cao (d) Hạch nấm (e) Túi bào tử (f) Lông cứng (g) Hình dạng (h) 1 CL1 1 + + 1 - 0 - 2 2 CL3 2 + + 2 - 0 - 1 3 CL5 2 + + 2 - 2 - 1 4 CL7 2 + + 2 - 1 - 2 5 CL10 4 + + 2 - 1 - 2 6 CL13 2 + + 2 - 1 - 2 7 CL14 2 + + 2 - 0 - 1 8 CL15 2 + + 2 - 0 - 2 9 CL17 2 + + 2 - 1 - 2 10 CL19 1 + + 2 - 0 - 2 11 CQ3 3 ++ ++ 1 - 2 + 2 12 CQ5 1 + + 2 - 1 - 1 13 CL21 2 + + 1 - 1 - 2 14 CL22 3 + + 2 - 1 - 2 15 CL25 4 + + 2 - 0 - 2 16 CL27 3 + + 2 - 0 - 2 17 CL28 4 + + 2 - 1 - 2 18 CL30 4 + + 2 - 0 - 1 19 CQ26 2 + + 2 - 2 - 2 20 CQ28 1 + + 2 - 0 - 1 21 CQ29 3 + + 2 - 0 - 2 22 NL2 2 + + 2 - 1 - 2 23 NL3 2 + + 2 - 1 - 2 24 NL5 2 + + 2 - 0 - 2 25 NL7 2 + + 2 - 0 - 1 26 NT3 4 + + 2 - 2 - 2 27 NQ2 4 + + 2 + 0 - 2 28 NQ4 1 + + 2 - 0 - 2 29 NQ6 2 + + 2 - 0 - 2 30 NKL1 4 + + 2 - 0 - 2 31 NKL3 1 + + 2 - 0 - 2 32 NKL5 4 + + 2 - 0 - 1 33 NKQ 1 + + 2 - 1 - 2
Ghi chú: CL: mẫu bệnh trên lá của giống Cardinal, CQ: mấu bệnh trên quả của giống Cardinal NL: mẫu bệnh trên lá của giống NH01-53, NQ: mẫu bệnh trên quả của giống NH01-53 NKL: mẫu bệnh trên lá và NKQ: mẫu bệnh trên quả của giống không có tên
ạ Màu sắc khuẩn lạc : 1.trắng ; 2. xám ; 3. trắng bẩn ; 4. xám nâu b. Mép khuẩn lạc: +.xốp ; ++. chắc
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
d. Chiều cao sợi nấm; 1. thấp ; 2. trung bình ; 3. cao ẹ Hạch nấm: -. không ; +. có
f. Túi bào tử : 0. hiếm ; 1. ắt ; 2. nhiều g. Lông cứng : -. không có ; +. có mặt
h. hình dạng bào tử : 1. trụ thẳng tròn một ựầụ 2.trụ thẳng tròn 2 ựầu
Trong 2 loài Elsinoe spp. và Colletotrichum gây bệnh thán thư mức ựộ gây hại của nấm Elsinoe spp. mạnh hơn và ựược xem là một tác nhân nghiêm trọng trên thế giớị Trong nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả ngược lại, mức ựộ gây hại của nấm Colletotrichum spp. cao hơn Elsinoe spp., ựiều này ựược khảng ựịnh khi thu thập mẫu bệnh thì tỷ lệ mẫu bệnh cao hơn.
3.2. Kết quả nghiên cứu ựặc ựiểm sinh học của bệnh thán thư
Chúng tôi chọn 7 isolate Elsinoe spp. và 20 isolate Colletotrichum spp. ựại diện cho các mẫu ở các giống thu thập.
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến ựường kắnh khuẩn lạc
3.2.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến ựường kắnh khuẩn lạc Elsone spp.
Các isolate ựược cấy trên môi trường PDA ựặt ở 6 nhiệt ựộ khác nhau 10oC, 20oC, 25oC, 30oC, 35oC và 40oC. Tại 40oC các isolate Elsinoe spp. không phát triển. Khi so sánh ựường kắnh khuẩn lạc giữa các isolate, chúng tôi nhận thấy nhiệt ựộ 25oC thắch hợp nhất cho sự phát triển, trung bình ựường kắnh khuẩn lạc là 46.90 mm. Nhiệt ựộ 300C trung bình ựường kắnh khuẩn lạc (41.57mm). Tại 10oC là 14.5 mm và 35oC trung bình ựường kắnh khuẩn lạc thấp nhất 20.52 mm. Qua biểu ựồ hình 3.6 cũng cho ta thấy nhiệt ựộ 25oC