2.2.1. Nguyên liệu nghiên cứu
- Mẫu lá, thân, quả nho bị bệnh thán thư ựược thu thập tại huyện Ninh Sơn, tỉnh Ninh Thuận trên các giống nho Cardinal, NH01- 48, NH01- 53Ầ ở giai ựoạn sắp thu hoạch và ựang thu hoạch.
- Mẫu nấm C. gloeosporioides 801(2) làm ựối chứng ựược cung cấp bởi TS. Nguyễn Thị Hằng Phương.
- Các loại môi trường WA, PDA, PDA lỏng, Czapek, CMA, PCAẦ Thành phần các loại môi trường:
Môi trường WA :
Agar : 8 g
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
Môi trường PDA :
Dịch chiết khoai tây : 230 ml
đường : 16 g
Agar : 8 g
Nước cất : 770 ml
Môi trường PDA lỏng :
Dịch chiết khoai tây : 230 ml
đường : 16 g
Nước cất : 770 ml
Môi trường Czapeck :
NaNO3 : 3,0 g K2HPO4 : 1,0 g MgSO4.7 H2O : 0,5 g KCl : 0,5 g FeSO4.7 H2O : 0,01g đường : 30 g Agar : 10 gam Nước cất : 1000 ml pH : 5.8 - 6.0
Môi trường PCA :
Cà rốt : 40 g
Khoai tây : 40 g
Agar : 8 g
Nước cất : 1000 ml
Môi trường CMA:
Ngô ngọt : 60 g
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
Nước cất : 1000 ml
2.2.2. Hóa chất
- Các hóa chất cở bản trong nghiên cứu tách chiết ADN, PCR, ựiện di ADN ựược cung cấp bởi các hãng Sigma hoặc Fermentas.
- Cặp mồi ITS4 : 5Ỗ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3Ỗ và CgInt : 5Ỗ- GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG-3Ỗ. ựược sử dụng ựể nhận dạng loài C. Goleosporioides [28, 45]. Sản phẩm khuếch ựại có kắch thước xấp xỉ 450 bp
trên gel agarose 1%.
- Các mồi OPA-2, OPA-3,OPA-11,OPA-13,OPB-6,OPB-7,OPG-17 ựược mua từ hãng Operon Biotechnology có trình tự như trong bảng 2.1 như sau:
Bảng 2.1 : Trình tự oligo sử dụng trong phản ứng RAPD-PCR
Tên mồi Trình tự OPA-2 5Ỗ-TGCCGAGCTG-3Ỗ OPA-3 5Ỗ-AGTCAGCCAC-3Ỗ OPA-11 5Ỗ-CAATCGCCGT-3Ỗ OPA-13 5Ỗ-CGACACCCAC-3Ỗ OPB-6 5Ỗ-TGCTCTGCCC-3Ỗ OPB-7 5Ỗ-GGTGACGCAG-3Ỗ OPG-17 5Ỗ-ACGACCGACA-3Ỗ
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập mẫu bệnh
Mẫu bệnh sau khi ựược thu thập về rửa dưới vòi nước chảy cho trôi hết chất bẩn. Sau ựó mẫu ựược khử trùng bằng cách ngâm trong NaOCl 1% từ 5 - 7 phút, tiếp theo khử trùng bằng cồn 70oC trong 3 - 5 phút, cuối cùng rửa bằng nước cất khử trùng 3 lần và thấm khô mẫu bằng giấy thấm khử trùng.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
Cắt mẫu cấy với kắch thước 0,5 Ờ 0,7 mm tại mép vùng bị bệnh (bao gồm cả vùng bị bệnh và vùng không bị bệnh). đặt từ 8-10 miếng cấy lên môi trường PDA có chứa kháng sinh Tetracylin (100 ộg/ml). Ủ tại nhiệt ựộ 25oC ổ 2. Quan sát ựĩa cấy hàng ngàỵ Khi thấy xuất hiện sợi nấm, cấy chuyển ngay sang môi trường PDA mới, ủ tiếp tại nhiệt ựộ trên.
2.3.2. Phương pháp làm thuần nấm bằng cấy bào tử ựơn
Khuẩn lạc nấm ựược ủ trong ựiều kiện nhiệt ựộ 25oC ổ 2, thường sau 5 ựến 7 ngày sẽ xuất hiện bào tử trên khuẩn lạc nấm. Thu bào tử nấm ựem hoà loãng trong nước cất khử trùng tại các nồng ựộ loãng dần 10-3, 10-4, 10-5.... Kiểm tra số lượng bào tử trong một giọt dịch bào tử trên lam kắnh dưới kắnh hiển vị Nếu số lượng bào tử hút không quá 3 bào tử có thể dùng ựể cấy bào tử. Hút 20 ộl dịch bào tử ở nồng ựộ pha loãng nhất nhỏ vào ựĩa petri nhựa chứa môi trường WA, dùng que thủy tinh trải ựều dịch bào tử trên bề mặt ựĩa ựem ủ ựĩa tại nhiệt ựộ phòng. Kiểm tra ựĩa cấy hàng ngày dưới dưới kắnh hiển vi Leica ựộ phóng ựại 10 x 0.65. Khi thấy bào tử nấm nảy mầm và phát triển thành sợi nấm, ựánh dấu và cắt chúng ựặt lên môi trường PDẠ Mẫu nấm phát triển trong ựĩa petri chứa môi trường PDA phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theọ Bảo quản nấm trong ống nghiệm chứa môi trường PDA nghiêng hoặc nước cất khử trùng tại 4oC [6,7].
2.3.3. Nghiên cứu ựặc ựiểm hình thái học
Nấm ựược cấy trên môi trường PDA, ủ tại nhiệt ựộ phòng. Sau 5 ựến 7 ngày tiến hành quan sát mô tả ựặc ựiểm khuẩn lạc, sợi nấm. Quan sát và mô tả các ựặc ựiểm sinh sản, cuống sinh bào tử, hạch nấm, bào tử dưới kắnh hiển vi ựiện tử ựộ phóng ựại 40x. Tiến hành ựo chiều dài, chiều rộng 20 bào tử ngẫu nhiên của mỗi chủng nấm dưới kắnh hiển vị
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu ựặc ựiểm sinh học
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ựộ: Isolate Ẹ ampelina và Colletotrichum. spp ựược cấy trên môi trường PDA và ựược ựặt ở các nhiệt
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
ựộ khác nhau: 10oC, 20oC, 25oC, 30oC, 35oC và 40oC (thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần). Theo dõi hàng ngày tiến hành ựo ựường kắnh khuẩn lạc của từng isolate theo hai ựường kắnh vuông góc kẻ ở mặt sau của ựĩạ Kết quả ựược ựo và ghi lại sau 6 ngày cấỵ
- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ựến ựường kắnh khuẩn lạc : Với 4 loại pH khác nhau pH 4, 5, 6 và 7 trên môi trường PDA, ựặt ở nhiệt ựộ 25oC ổ 2, (mỗi isolate ựược lặp lại 3 lần). đo ựường kắnh của các isolate theo 2 ựường kắnh vuông góc kẻ ở mặt sau của ựĩa ựược ghi lại sau 6 ngàỵ
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường : Mỗi isolate ựược cấy trên các môi trường CMA, PCA, Czapeck và PDA, ủ tại nhiệt ựộ 25oC ổ 2(thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần). đo ựường kắnh khuẩn lạc phát triển của các isolate theo 2 ựường kắnh vuông góc kẻ ở mặt sau của ựĩa khi ựược 6 ngày cấỵ
Tất cả số liệu ựược xử lý thống kê Anova: Two - Factor With Replication theo chương trình Microsoft excel 2003 [4].
2.3.5. đánh giá ựộc tắnh gây bệnh của một số chủng nấm bệnh trên lá, quả của cây nhọ của cây nhọ
20 isolate Colletotrichum spp. và 7 isolate Elsinoe spp. cấy trên môi trường PDA ựặt dưới ựèn UV nhằm kắch thắch nấm sinh bào tử. Sau khi xuất hiện bào tử ựem pha dịch bào tử lây nhiễm với nồng ựộ 2 x 106 bào tử/ộl [7,29].
Lá và quả nho sạch bệnh ựược ngắt về ựem rửa sạch dưới vòi nước, ựặt trên khay lót giấy thấm khử trùng và có giữ ẩm. Mỗi isolate nhiễm trên 6 lá và 6 quả với 3 lần nhắc lạị Bơm 20 ộl dịch bào tử trên mỗi lá hoặc quả sau 24h bơm tiếp dịch bào tử ựể trong 12h tối và 12h sáng phủ khay nhiễm bằng túi nilông trắng, ựặt nhiệt ựộ 25oC ổ 2. Khay ựối chứng sử dụng nước cất khử trùng ựể bơm thay cho dịch bào tử nấm. Luôn giữ ẩm trong khay nhiễm bằng
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
phun nước cất khử trùng lên giấy thấm hàng ngàỵ Sau 7 ngày chụp ảnh triệu chứng gây bệnh và ựánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh trên lá hoặc quả theo công thức:
Tỷ lệ nhiễm bệnh trên lá (quả) (%) = x 100
2.4. Phương pháp sinh học phân tử ựịnh danh loài Colletotrichum spp. bằng kỹ thuật PCR. bằng kỹ thuật PCR.
2.4.1. Nuôi lỏng nấm tạo sinh khối là nguyên liệu tách chiết ADN
Mẫu nấm Colletotrichum spp. ựược nuôi trong môi trường PDA lỏng với 100 ml ựược ựựng trong lọ tam giác 250 ml ựể trong phòng thắ nghiệm nhiệt ựộ 25 Ờ 30oC. Sau 7 ngày thu sinh khối bằng máy hút chân không và giấy lọc khử trùng, sinh khối ựược rửa bằng nước cất khủ trùng từ 3 Ờ 4 lần ựể loại bỏ tạp chất thu ựược sợi nấm sạch và làm khô sợi nấm. Mẫu ựược cất giữ trong tủ lạnh sâu Ờ 20oC làm nguyên liệu tách chiết ADN tổng số.
2.4.2. Tách chiết ADN isolate Colletotrichum spp.
Dùng cối chày sứ và nitơ lỏng ựể nghiền các mẫu thành dạng bột mịn và cho vào ống eppendorf 2 ml cất vào tủ - 20o C.
Chúng tôi sử dụng quy trình tách chiết ADN tổng số của Aga et al.
(2003) gồm các bước sau [8]:
- Bước 1: Cân khoảng 300 mg mẫu nấm (ựã nghiền với nitơ lỏng thành dạng bột mịn) cho vào ống eppendorf 2ml.
- Bước 2: Bổ sung 750ộl Extraction buffer và 100ộl 10% SDS.
- Bước 3: Ủ ở nhiệt ựộ 65oC, thỉnh thoảng lắc nhẹ cho ựềụ
- Bước 4: Thêm 250 ộl 5M KAC, ly tâm 1000 vòng/ phút. Sau ựó ủ 30 phút trong ựá. Ly tâm các mẫu với tốc ựộ 14.000 vòng/phút trong 15 phút.
Số lá (quả) bị nhiễm bệnh
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
- Bước 5: Hút phần dịch nổi ở phắa trên ựược chuyển sang 2 ống eppendorf 1,5 ml mớị Bổ sung lượng thể tắch isopropanol lạnh bằng lượng lần thể tắch ban ựầu, lắc nhẹ và ủ trong -20oC trong 30 phút.
- Bước 6: Ly tâm các mẫu với tốc ựộ 14000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ phần nước ở trên, lấy phần tủa ở dướị
- Bước 7: Bổ sung 250 ộl 1xTE ựể hoà tan kết tủa ADN. Sau ựó bổ sung 250 ộl dung dịch ựệm CTAB. Lắc nhẹ.
- Bước 8: Ủ ở 65oC trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ.
- Bước 9: Bổ sung một lần thể tắch hỗn hợp Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (tỷ lệ 25: 24: 1 tương ứng theo thể tắch). Ly tâm với tốc ựộ 14.000 vòng/phút trong 5 phút. Hút phần dịch trên sang ống mớị Lặp lại bước 9. - Bước 10: Bổ sung một lần thể tắch isopropanol lạnh. Ủ trong -20oC trong 30 phút.
- Bước 11: Ly tâm với tốc ựộ 14.000 vòng/phút trong 15 phút. Bỏ phần dịch lấy phần kết tủa và ựể khô tủạ
- Bước 12: Sau khi tủa khô hoà tan ADN trong 100 ộl nước hoặc 1xTE, thêm 2,5 ộl 1mg/ml 30 phút trong tủ 37o C. Bất hoạt RNAse 10 mg bằng nhiệt ở 65oC trong 10-15 phút, sau ựó mẫu ADN tổng số ựược cất giữ phục vụ các thắ nghiệm tiếp theọ
Các mẫu ADN tổng số sau ựó sẽ ựược kiểm tra chất lượng bằng phương pháp ựiện di trong 1X TAE trên gel agarose 1% tại 110 V trong 30 phút. Sản phẩm sau ựó ựược ngâm trong ethidium bromide, rửa bằng nước soi trên máy Gel - Dox.
2.4.3. định lượng ADN bằng phương pháp ựo ựộ hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260/280nm
Xác ựịnh ựộ tinh sạch của mẫu ADN và ựo quang phổ hấp thụ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
định lượng bằng máy Nanodrop ND -1000 Spectrophotometer ở bước sóng 260/280nm. độ tinh sạch ựược xác ựịnh bằng tỉ số A260/A280 ựạt ựến 1.8- 2 thì có thể coi ADN ựã tách chiết ựủ ựộ sạch dùng cho các kỹ thuật sinh học phân tử tiếp theọ
2.4.4. Phản ứng PCR ựặc hiệu
để xác ựịnh một cách chắnh xác ựó có phải loài C.gloeosprioides chúng tôi tiến hành phản ứng ựặc hiệụ Từ các mẫu ADN tổng số thu ựược từ
Colletotrichum spp. Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi ITS4/CgInt kắch thước band 450bp ựúng là loài C.gloeospoides.
Phản ứng ựược thực hiện với thể tắch 20 ộl hỗn hợp chứa dung dịch ựệm PCR 10x (MgCl2), dNTP 2mM, ITS4 10mM, CgInt 10mM, 0,2 ộl Taq polymerase 5U/ ộl (Fermentas), 20 - 50 ng mẫu ADN [39].
Phản ứng ựược chạy bằng máy nhân gen Applied Biosystems 9700. Chu trình chạy PCR bao gồm bước dãn xoắn ở 94oC trong 4 phút, tiếp theo 34 chu kỳ tại nhiệt 94oC trong 1 phút, 58oC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút, kết thúc 72oC trong 7 phút. Sản phẩm PCR sau ựó ựược chạy trên agarose 1% trong bể ựiện di 1.0 X TAE, 110V, 30- 35 phút. Ngâm sản phẩm trong ethidium bromide 30 phút và tráng qua với nước. Soi dưới ựèn UV, chụp ảnh trên máy Canon EOS 40D.
2.4.5. Phản ứng RAPD Ờ PCR (Random Amplified Polymorphic ADN)
Phản ứng RAPD dựa vào nguyên tắc PCR sử dụng các ựoạn mồi có trình tự ngẫu nhiên nghiên cứu quan hệ di truyền Colletotrichum. spp. Sử dụng marker 1kb của Fermentas (GeneRuler Ỏ 1 kb DNA Thang, 250-10000 bp) Phản ứng PCR ựược thực hiện với thể tắch 20 ộl chứa dung dịch ựệm phản ứng 10X, 20 ng mẫu ADN , 100 ộM dNTP, 20 ng mồi, 0.2ộl 5U Taq Polymerase (Fermentas).
Chu trình chạy PCR: Bắt ựầu với 94oC trong 3 phút, sau ựó 45 chu kỳ bao gồm 94oC trong 1 phút, nhiệt ựộ gắn mồi 32oC trong 1 phút, 72o C trong 2
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
phút và kết thúc 7 phút 72oC. Sản phẩm chạy agarose 1,2 % trong bể ựiện di 1.0 X TAE, 110V, 30- 35 phút. Ngâm trong ethidium bromide 30 phút và rửa trong nước soi bằng máy Gel - Dox
Các băng ADN ựược ghi nhận sự có mặt hoặc vắng mặt của chúng trên gel, các băng xuất hiện ựược chấm là 1 và các băng không xuất hiện ựược chấm là 0. Các số liệu này ựược xử lý theo chương trình Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System computer program vesion 2.01 (NTSYS-pc2.01) (F.J Rohlf., 2000) ựể xác ựịnh hệ số tương ựồng di truyền và xây dựng cây quan hệ di truyền.
- Hệ số ựồng dạng di truyền có thể ựược tắnh theo công thức của M. Nei & Li (1979)
Trong ựó: Ni: số vạch của giống i Nij: số vạch chung của 2 giống i và j Nj: sốvạch của giống j Sij: Hệ số tương ựồng giữa i và j
2Nij Sij=
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
CHƯƠNG IIỊ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu bệnh thán thư
Các mẫu bệnh ựược thu thập tại các vườn nho thuộc huyện Ninh Sơn, tỉnh Ninh Thuận trong giai ựoạn bước vào thời kỳ thu hoạch, tháng 10 Ờ 11 năm 2010. Tổng số mẫu nho bị bệnh thu thập ựược gồm 95 mẫụ Dựa vào ựặc ựiểm triệu chứng trên các mẫu bệnh ựược chia làm hai nhóm (bảng 3.1).
Bảng 3.1: Số mẫu thu thập tại Ninh Sơn, Tỉnh Ninh Thuận
Giống Triệu chứng nhóm I Triệu chứng nhóm II
Cardinal 0 0 30 mẫu lá 10 mẫu quả
NH01-48 5 mẫu lá 15 mẫu quả 0 0
NH01-53 0 0 20 mẫu lá 5 mẫu quả
Không rõ tên giống 0 0 5 mẫu lá 5 mẫu quả
Tỷ lệ mẫu bệnh (%) 21 78.94
Trong ựó tỷ lệ mẫu bệnh nhóm II (78.94%) cao hơn tỷ lệ mẫu bệnh nhóm I (21%): mẫu bệnh thuộc nhóm I có triệu chứng ựiển hình trên lá xuất hiện nhiều chấm nhỏ, hình tròn, màu hơi ựỏ, vết ựốm sau ựó lan rộng, trở nên hõm xuống, gây nên vết thương ở giữa có màu xám, với mép xung quanh hình tròn. Mép vết bệnh màu nâu ựỏ tối ựến tắm ựen. Trên quả có những chấm màu ựỏ tròn. Các ựiểm chấm lớn dần ựường kắnh trung bình (2- 5 mm) và ăn lõm sâu vào quả có màu nâu ựỏ ựến ựen giống như mắt chim. Quả bị bệnh nặng không phát triển, tại vết bệnh nứt ra, cuống trái to xù ra có màu ựen (hình 3.1). Triệu chứng của mẫu bệnh chúng tôi thu thập ựược giống với những mô tả bệnh thán thư (ựốm mắt chim) của nhiều tác giả trong và ngoài nước [5,10].
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
Hình 3.1 : Triệu chứng nhóm I trên lá, quả cây nho
Ạ Triệu chứng bệnh trên lá; B, C.Triệu chứng bệnh trên quả
Từ 20 mẫu triệu chứng nhóm 1 chúng tối tiến hành phân lập các mẫu bệnh và tiến hành làm thuần . Từ những mẫu cấy trên môi trường PDA, sau 3- 4 ngày xuất hiện những khối nấm màu vàng, dai và hơi cứng. Khi soi dưới kắnh hiển vi chúng tôi phát hiện thấy rất nhiều bào tử. Sau khi chuyển sang môi trường PDA mới, chúng phát triển thành những khuẩn lạc màu vàng ựậm, thành khối có bề mặt gồ ghề gợn sóng với hệ sợi mềm ăn sâu vào bên trong môi trường,tốc ựộ phát triển rất chậm, sợi nấm ép chặt vào môi trường. Bào tử nấm soi dưới kắnh hiển vi có dạng ựơn bào, hình cầu trong suốt, kắch thước