RFLP là kỹ thuật ựược sử dụng lần ựầu tiên vào năm 1975, ựược ựịnh nghĩa là tắnh ựa hình chiều dài các phân ựoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kắch thước các phân ựoạn ựược tạo ra khi cắt ADN bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay ựổi trình tự trên ADN bộ nhân hoặc trong các bào quan khác.
Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên ựộ ựặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (RE) ựối với vị trắ nhận biết của chúng trên ADN bộ gen. ADN bộ gen sẽ ựược cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy ựiện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò ADN (ựược ựánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus ựặc biệt. Sự khác biệt vị trắ cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân ựoạn cắt khác nhaụ RFLP có ưu ựiểm là marker ựồng trội cho phép phân biệt ựược cá thể ựồng hợp và dị hợp. Do kắch thước ADN khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều ựủ ựáp ứng nhu cầu nghiên cứụ Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm ựối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ ựánh dấu), ADN yêu cầu có chất lượng cao ựã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật nàỵ Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên ựơn giản hơn. Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch ựại một vùng ADN cần khảo sát, sau ựó ựoạn ADN ựược khuếch ựại ựược cắt bằng các RE, ựiện di và phân tắch trên
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc. PCR-RFLP bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ hơn và ắt nguy hiểm hơn phương pháp RFLP[49].
1.5.2. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Kỹ thuật AFLP ựược hiểu là sự ựa dạng của các ựoạn ADN ựược nhân lên có ựịnh hướng sau khi bị cắt bởi 2 enzim giới hạn, sử dụng những phân ựoạn ADN làm khuôn cho phản ứng khuếch ựại PCR. AFLP là một trong những kỹ thuật in dấu ADN ựược phát triển bởi Vos và cộng sự năm 1995. Kỹ thuật này là một công cụ hữu ắch ựể xác nhận nhiều locus của ựa hình ADN mà không cần phải biết trước thông tin về trình tự ADN của chúng (Michelmore và ctv., 1998), phương pháp này có thể ựưa ra nhanh chóng một ước lượng ựộ ựa dạng di truyền trong và giữa những quần thể với nhau (Breyen và ctv., 1997; Cervera và ctv, 1996)
Nguyên tắc của phương pháp AFLP cũng giống như RFLP, ựiểm khác biệt cơ bản là AFLP không cần tiến hành lai phân tử (lai Southern blot), do vậy thực hiện nhanh hơn. Kỹ thuật AFLP gồm hai nội dung cơ bản là:
- Cắt ADN bằng enzim giới hạn có bổ sung các adaptor ựặc hiệu tạo nên các ựoạn mút giống nhau, ựặc trưng cho các mồi ựã chọn trước. Cặp enzyme thường ựược dùng nhất là EcoRI Ờ MseỊ đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự ựặc hiệu cho vị trắ cắt enzymẹ
- Khuếch ựại ựoạn ADN bằng kỹ thuật PCR ngắt quãng với hai loại mồi khác nhaụ Mồi của phản ứng PCR ựược thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotidẹ Chỉ những phân ựoạn ADN nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới ựược khuếch ựại, chắnh trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm ựơn giản quá trình phân tắch [49].
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
Phương pháp này lần ựầu tiên ựược nêu ra bởi Olson năm 1989 trong nghiên cứu lập bản ựồ gen ở người ngay sau khi kỹ thuật PCR ra ựời (Olson và cs., 1989). Loại chỉ thị này ựược ựưa ra nhờ việc xác ựịnh trình tự 2 ựầu các ựoạn mẫu dò RFLP, trên cơ sở ựó người ta thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR [38].