* Phương pháp lấy mẫu:
- Với gà dưới 2 tuần tuổi, lấy máu tim với lượng 0,5ml/con.
- Với gà trên 2 tuần tuổi, lấy máu tĩnh mạch gốc cánh với lượng 1ml/con. Sau khi lấy máu vào bơm tiêm nhựa, bẻ gập kim, ựậy nắp, ựể nghiêng 300 ở ngoài môi trường khoảng 30 phút cho máu tự ựông rồi bỏ vào phắch ựá lạnh và gửi ựến phân xưởng vacxin virus Ờ Xắ nghiệp thuốc thú y trung ương Ờ Hoài đức Ờ Hà Nội.
* Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà HA:
Dựa trên nguyên lý virus Newcastle co khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà, bò, người do trên bề mặt capsid có kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu và
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 37
làm virus có khả năng bám vào các thụ thể của hồng cầu, làm hồng cầu ngưng kết lại nằm rải rác thành hình mạng nhện dưới ựáy ống nghiệm. Sau ựó men Neuraminidaza cắt ựứt thụ thể hồng cầu làm hồng cầu lắng xuống ựáy thành cục tròn ựỏ. Do vậy, ở giai ựoạn ựầu của phản ứng mới cho kết quả chắnh xác.
Chuẩn bị:
+ Hồng cầu gà 1%: lấy máu tim gà (khỏe mạnh, phản ứng HI âm tắnh) vào xi lanh có chứa citrat natri 5%. Ly tâm 2000 vòng/phút/10 phút, hút bỏ phần bạch cầu và huyết tương ựi rồi cho nước sinh lý vào, trộn ựều quay ly tâm loại bỏ phần nước trong phắa trên. Làm như thế 3 lần ta thu ựược hồng cầu. Lấy 1ml hồng cầu pha với 99ml nước sinh lý ta thu ựược hồng cầu 1%.
+ Kháng nguyên là virus Newcasle; nước sinh lýẦ + Phản ứng ựược tiến hành theo sơ ựồ sau:
Giếng Nguyên liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 đC (-) Nước sinh lý (ộl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Kháng nguyên Newcastle (ộl) 25
Hiệu giá virus 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/216 1/512 1/1024
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 38
Dùng micropipettes nhỏ vào tất cả các giếng, mỗi giếng 25ộl nước sinh lý. Sau ựó cho vào giếng thứ nhất 25ộl kháng nguyên Newcastle. Trộn ựều rồi hút sang giếng thứ hai 25ộl, tiếp tục làm tương tự như vậy cho ựến giếng thứ 10 thì hút bỏ ựi 25ộl. Lúc này hiệu giá kháng nguyên pha loãng từ giếng 1 ựến giếng 10 lần lượt là 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; Ầựến 1/512; 1/1024. Tiếp ựó cho vào tất cả các giếng 25ộl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ, ựể yên trong 20 phút rồi ựọc kết quả.
đọc kết quả
Phản ứng dương tắnh: Hồng cầu bị ngưng kết rải ựều thành mảng ở ựáy giếng.
Phản ứng âm tắnh: Hồng cầu lắng xuống ựáy thành cục tròn ựỏ, nước ở bên trong.
Hiệu giá ngưng kết: đọc ở giếng ngưng kết cuối cùng trước giếng không ngưng kết.
Hiệu giá phản ứng HA: là ựộ pha loãng virus cao nhất mà ở ựó vẫn còn ngưng kết hồng cầu, người ta gọi ựó là 1 ựơn vị HA.
Trong phản ứng HI phải sử dụng kháng nguyên là virus Newcastle pha ở 4 ựơn vị HA, ựể phản ứng chắnh xác hơn cần xác ựịnh 4 ựơn vị HA. Cụ thể chúng tôi làm phản ứng HA với kết quả 1HA = 1/1024, nên 4HA = 1/216.
Xác ựịnh 4 ựơn vị HA
Trên tấm nhựa microtest plate dùng 4 dãy, 4 giếng. Nhỏ vào mỗi giếng 25 ộl nước sinh lý. Nhỏ vào giếng 1 của 4 dãy: 25ộl kháng nguyên ựã pha ở 4 ựơn vị HA, trộn ựều, hút 25ộl từ giếng 1 sang giếng 2 và làm tương tự cho tới giếng
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 39
thứ 3 hút bỏ ựi 25ộl. Hiệu giá HA của các giếng là: giếng thứ 1 có 2 ựơn vị HA, giếng thứ 2 có 1 ựơn vị HA, giếng 3 có 0,5 ựơn vị HA. Sau ựó nhỏ hồng cầu 1% vào tất cả các giếng, giếng thứ 4 làm ựối chứng chỉ có nước sinh lý và hồng cầu.
Lắc nhẹ tấm nhựa, ựể yên 20 phút rồi ựọc kết quả. Nếu hiện tượng ngưng kết hồng cầu chỉ xảy ra ựến giếng thứ 2 thì kháng nguyên pha ựúng ở 4 ựơn vị HA.
* Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà HI:
Dựa trên nguyên lý gà mắc bệnh Newcastle hoặc ựã ựược tiêm phòng vacxin
Newcastle thì trong huyết thanh có kháng thể ựặc hiệu chống lại virus Newcastle, kháng thể trung hòa virus làm nó mất khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà.
Chuẩn bị:
+ Hồng cầu gà 1%; kháng nguyên là virus Newcastle pha ở 4 ựơn vị HA; huyết thanh gà cần chẩn ựoán; nước sinh lýẦ.
+ Phản ứng ựược tiến hành theo sơ ựồ sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giếng Nguyên liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 đC (-) đC (+) Nước sinh lý (ộl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 Huyết thanh gà (ộl) 25 độ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/216 1/512 1/1024 Kháng nguyên Newcastle (4 HA) (ộl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Hồng cầu gà 1% (ộl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 40
Dùng khay nhựa có 96 giếng ựáy chữ U (có 8 dãy giếng, mỗi dãy giếng dùng cho một mẫu huyết thanh).
Dùng micropipettes nhỏ vào tất cả các giếng, mỗi giếng 25ộl nước sinh lý, riêng ô ựối chứng (+) cho 50ộl nước sinh lý.
Sau ựó cho vào ô thứ nhất 25ộl huyết thanh cần kiểm tra, trộn ựều rồi hút sang giếng thứ hai 25ộl. Tiếp tục làm như vậy cho tới giếng thứ 10 rồi hút bỏ 25ộl ựi. Lúc này hiệu giá huyết thanh pha loãng từ giếng 1 ựến giếng 10 lần lượt là 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; Ầựến 1/512; 1/1024.
Tiếp ựó cho 25ộl kháng nguyên pha ở 4 ựơn vị HA vào tất cả các giếng trừ giếng ựối chứng (+). Lắc nhẹ, ựể ở nhiệt ựộ phòng trong vòng 30 phút cho kháng nguyên kết hợp với kháng thể nếu có.
Tiếp tục cho hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng, lắc nhẹ, ựể ở nhiệt ựộ phòng trong vòng 20 phút rồi ựọc kết quả.
đọc kết quả
Phản ứng âm tắnh: Hồng cầu bị ngưng kết rải ựều dưới ựáy ống nghiệm. Phản ứng dương tắnh: Hồng cầu lắng xuống ựáy thành cục tròn ựỏ, nước bên trong do virus Newcastle bị kháng thể Newcastle có trong huyết thanh trung hòa không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu.
Hiệu giá HI là ựộ pha loãng huyết thanh cao nhất tại ựó kháng thể vẫn còn khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 41
Thông qua hiệu giá HI người ta ựánh giá mức ựộ miễn dịch của ựàn gà. Hiệu giá HI (log2) từ 1/8 trở lên ựược coi là có khả năng bảo hộ với bệnh Newcastle. Hiệu giá HI càng cao thì khả năng bảo hộ càng lớn.
Thắ nghiệm ựược tiến hành trên 60 gà (30 gà rừng Tai ựỏ thuần và 30 gà lai F2).