3. đỐI TƯỢNG, đỊA đIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ
3.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1 Từ các báo cáo tình hình dịch cúm gia cầm và kết quả tiêm phòng vacxin cúm gia cầm của các Trạm Thú y, Chi cục Thú y Bắc Ninh. Lập bảng biểu số liệu dịch tễ của bệnh cúm gia cầm. Kết quả tiêm phòng vacxin H5N1, H5N2 qua các năm từ 2005-2010.
- Số liệu thu thập ựược nhập vào chương trình Ms Excel 2007 ựể tắnh tỷ lệ mắc bệnh và buộc phải tiêu hủy, tỷ lệ mắc bệnh và buộc phải tiêu hủy của gà, tỷ lệ mắc bệnh và buộc phải tiêu hủy của thủy cầm.
Số gia cầm MB và BPTH
Tỷ lệ MB và BPTH = ừ100 Tổng ựàn gia cầm tại thời ựiểm ựó Số gà MB và BPTH
Tỷ lệ MB và BPTH của gà = ừ100 Tổng ựàn gia cầm tại thời ựiểm ựó Số thủy cầm MB và BPTH
Tỷ lệ MB và BPTH của thủy cầm = ừ100 Tổng ựàn gia cầm tại thời ựiểm ựó
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
3.4.2. Xác ựịnh hiệu giá kháng thể của gà, vịt tiêm vacxin H5N1 bằng phản ứng HI.
3.4.2.1. Phản ứng HI: Phản ứng HI dùng ựể xác ựịnh kháng thể trong huyết thanh của gà, vịt ựược tiêm vacxin H5N1.
* Nguyên liệu ựể tiến hành phản ứng HI bao gồm:
a)Kháng nguyên chuẩn: kháng nguyên là virus cúm subtype H5 chuẩn. - Chuẩn ựộ hiệu giá kháng nguyên bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA). + Cho 25ộl PBS (pH7,2) vào tất cả các giếng.
+ Cho 25ộl kháng nguyên vào các giếng từ A1 ựến H1, pha loãng bậc 2 kháng nguyên. Chuyển 25ộl từ giếng 1 ựến giếng 11 rồi bỏ ựi 25ộl.
+ Cho 25ộl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng.
+ Cột 12 dùng làm ựối chứng, chỉ chứa 25 ộl PBS và 25 ộl hồng cầu gà 1%. + Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy. để ở nhiệt ựộ phòng trong 30 phút. đọc kết quả.
+ Hiệu giá kháng nguyên tắnh ựến ựộ pha loãng cuối cùng còn khả năng làm ngưng kết hồng cầu gà ựược gọi là 1 ựơn vị HA.
Trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu dùng kháng nguyên 4 ựơn vị (4 ựơn vị HA) pha trong dung dịch pha loãng kháng nguyên.
b) Hồng cầu: hỗn dịch hồng cầu 1% ựược chuẩn bị từ hồng cầu gà trống trưởng thành, không có kháng thể cúm và Newcastle ựược lấy máu ở tĩnh mạch cánh bằng seringer 5ml có chứa 1ml Natri citrat 5%.
Rửa hồng cầu: cho PBS (pH 7,2) vào ống ly tâm chứa hồng cầu lắc nhẹ. Ly tâm 1000-1500 vòng/1 phút trong 10 phút. đổ bỏ huyết tương ở trên, cho PBS rửa hồng cầu tiếp 2-3 lần ựến khi dung dịch ở phắa trên trong là ựược.
Pha hồng cầu 1%: ựổ bỏ nước trong ở trên, lấy 1ml hồng cầu cho vào 99ml PBS lắc ựều. Bảo quản ở 40C, 4-5 ngày.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
c) Huyết thanh: Lấy máu của gà, vịt khỏe mạnh ựã ựược tiêm phòng vacxin H5N1 vào seringe, ựể máu ựông chắt lấy huyết thanh ra các tube, ựánh dấu, ghi số lab.
Xếp các tube huyết thanh vừa chắt ựược vào khay, ựem xử lý nhiệt ở 560C/30 phút trong nồi hấp cách thủy ựể diệt bổ thể.
Huyết thanh sau khi ựược xử lý bảo quản trong tủ 40C ựể dùng ngay hoặc bảo quản ở tủ -200C ựể dùng sau.
* Tiến hành phản ứng
Nhỏ 25 ộl PBS vào các giếng ựáy chữ V của ựĩa 96 giếng. Nhỏ tiếp 25 ộl huyết thanh vào giếng ựầu tiên.
Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 ộl huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự ựến giếng 11.
Nhỏ 25 ộl kháng nguyên 4 ựơn vị HA ựã chuẩn bị vào các giếng từ 1- 11. Thêm 25 ộl vào hàng ựối chứng hồng cầu (giếng 12).
Lắc ựĩa và ủ ở nhiệt ựộ phòng 30 phút.
Nhỏ 25 ộl dung dịch hồng cầu 1% vào tất cả các giếng của ựĩa, lắc ựều. để ở nhiệt ựộ phòng 40 phút.
* đọc kết quả:
Phản ứng dương tắnh (+): hồng cầu lắng xuống ựáy. Hiệu giá HI của mẫu ựược tắnh ở ựộ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng âm tắnh (-):có các hạt ngưng kết ở ựáy lỗ.
3.4.3. Giám ựịnh virus cúm gia cầm chủng H5N1 bằng phương pháp RT-PCR
3.4.3.1. Phương pháp RT-PCR
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
- Cho 0,75 ml Trizol O LS reagen +0,25ml dung dịch bệnh phẩm vào ống 1,5ml. Lắc ựều và ựể ở nhiệt ựộ phòng 5 phút.
- Thêm 0,2 ml chloroforn vào mỗi ống. Lắc mạnh trong 15 giây và ựể ở nhiệt ựộ phòng 5 phút.
- Ly tâm ống ở tốc ựộ 12.000 g trong 15 phút ở 40C.
- Chuyển phần nước ( khoảng 500 ộl) sang ống microtube mới.
- Thêm 0,5 ml Isopropanol và lắc ựều. để 5-10 phút ở nhiệt ựộ phòng. - Ly tâm ống ở tốc ựộ 10.000 g trong 5 phút ở 40C. Bỏ dung dịch trong ống ựi. - Rửa ARN ựóng ở ựáy ống bằng cồn 80% lắc mạnh và ly tâm với tốc ựộ 10.000 g trong 5 phút ở 40C.
- Bỏ dung dịch trong ống và làm khô ARN 10 phút ở nhiệt ựộ phòng và hòa tan lại với 30 ộl nước cất không có Rnase hoặc nước cất ựã xử lý DEPC.
* Tiến hành kỹ thuật RT-PCR
- Công thức áp dụng cho kắt RT-PCR1 bước của hãng Qiegen. H2O 12 ộl 5X Buffer 5 ộl dNTP 1 ộl Enzyme mix 1 ộl Primer forward 0,5 ộl Primer reverse 0,5 ộl Mẫu ARN 5 ộl Tổng cộng 25 ộl
* Chu trình nhân gen
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 38 420C - 10 phút 420C-450C - 30 phút 950C - 15 phút 940C - 30 giây (tách sợi) 500C - 30 giây (gắn Primer) 720C - 1 phút (kéo dài) Chu trình 35 - 40 vòng 720C - 10 phút Giữ ở 40C
Quy trình nhân gen này áp dụng cho Primer H5 ( 936 và R1299) và N (F6 và R595).
* Chạy ựiện di
- Chuẩn bị thạch agarose 1,5% pha trong dung dịch TAE hoặc TBE có Ethidium Bromide (10 ộg/ộl).
- đổ thạch vào khuôn ựiện di (có lược).
- Thạch khô, rút nước ra và cho mẫu vào các giếng (5 ộl sản phẩm PCR + 2 ộl dung dịch loading buffer).
- Sử dụng Marker trọng lượng phân tử (thang 100bp).
- Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu ựối chứng dương và ựối chứng âm ựi kèm (mẫu ựối chứng âm có thể là nước cất sạch).
* đọc kết quả
- Mẫu dương tắnh (+): xuất hiện vạch giống với mẫu ựối chứng dương tắnh. - Mẫu âm tắnh (-): không có vạch.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
* đánh giá kết quả
Có virus cúm hoặc virus cúm thuộc subtype nào dựa vào Primer chạy mẫu.
3.4.3.2. Phân lập virus trên phôi gà
Phân lập virus từ mẫu dịch ổ nhớp, dịch hầu họng... bằng cách tiêm huyễn dịch trên ựã ựược xử lý vào túi niệu phôi gà 9-11 ngày tuổi.
a) Thu thập bệnh phẩm: bệnh phẩm có thể là dịch ổ nhớp, dịch hầu họng, thận, phổi...
b) Bảo quản: ở nhiệt ựộ 00C ở trong phòng thắ nghiệm hoặc 1-40C trong thời gian vận chuyển mẫu về phòng thắ nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
c) Sử lý bệnh phẩm: mẫu ựược nghiền trong cối chày sứ, sau pha với nước sinh lý nồng ựộ 5-10%, cho kháng sinh Penicyline, Streptomycine, Kanamycine, từ 200.000-500.000 UI/1ml. Huyễn dịch ựược cho vào lọ hoặc ống nghiệm ựể ở nhiệt ựộ 40C, thời gian diệt tạp khuẩn từ 2-4 giờ. Ly tâm 2.000-3.000 vòng/phút, lấy nước trong ở trên tiêm truyền trên phôi gà 9-11 ngày tuổi.
d) Tiêm truyền bệnh phẩm:
- đặt trứng lên khay, xoay buồng hơi lên phắa trên.
- Sát trùng vỏ trứng và ựục một lỗ trên buồng hơi bằng dùi ựục chuyên dụng. - Dùng seringer tiêm huyễn dịch bệnh phẩm ựã xử lý ở trên theo lỗ ựã ựục vào túi niệu của phôi gà 9-11 ngày tuổi, lượng 0,1-0,2 ml huyễn dịch bệnh phẩm/ phôi. Mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm 3 phôi.
- Gắn lỗ ựục bằng keo gắn vỏ trứng hoặc parafin.
- Ấp trứng ở 370C trong 5-7 ngày (loại các trứng chết trước 24 giờ).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
-Trước khi mổ khám thu hoạch nước trứng phải cất trứng vào tủ lạnh 40C trong 4 giờ hoặc ựể ở nhiệt ựộ - 200C trong 20 phút, mổ khám thu hoạch nước trứng, kiểm tra sự phát triển của phôi, bệnh tắch phôi, so sánh với phôi ựối chứng không tiêm bệnh phẩm.
- Bảo quản nước trứng ựã thu hoạch ựược trong tủ -700C.
- Mẫu ựã phân lập ựược kiểm tra bằng phản ứng HA. Nếu âm tắnh có thể cấy trên phôi gà thêm 2-3 lần.
Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) dùng ựể chuẩn ựộ virus phân lập từ bệnh phẩm. Dùng ựĩa phản ứng ngưng kết ựáy chữ U gồm 12 cột và 8 hàng.
* Tiến hành phản ứng HA ựể xác ựịnh virus trong nước trứng:
Cho 25ộl PBS (pH7,2) vào tất cả các giếng.
Cho 25ộl nước trứng vào các giếng từ A1 ựến H1 (cột ựầu tiên).
Pha loãng bậc 2 nước trứng bằng cách chuyển 25ộl từ giếng 1 ựến giếng 11 rồi bỏ ựi 25ộl.
Cho 25ộl hồng cầu gà 1% vào các giếng phản ứng.
Cột 12 dùng làm ựối chứng, chỉ chứa 25 ộl PBS và 25 ộl hồng cầu gà 1%. Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy. để ở nhiệt ựộ phòng trong vòng 30 phút.
* đọc kết quả:
Phản ứng âm tắnh (-): hồng cầu lắng ựều ở dưới ựáy giếng.
Phản ứng dương tắnh (+): xảy ra hiện tượng ngưng kết, hồng cầu ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 41