2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.5.CHẨN đOÁN BỆNH
Chẩn ựoán bệnh do virus cúm A chủ yếu là phải phân lập và ựịnh danh ựược virus thông qua các xét nghiệm phi lâm sàng kết hợp triệu chứng lâm sàng, mổ khám bệnh tắch và dịch tễ học của bệnh.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
Có thể sử dụng nhiều phương pháp ựể chẩn ựoán xác ựịnh bệnh do nhiễm virus cúm gia cầm.
* Phân lập virus
Có thể lấy bệnh phẩm là dịch ngoáy hầu họng, dịch ổ nhớp hoặc các tổ chức phổi, khắ quản, não, gan, lách, tim. Mẫu sau khi lấy ựược bảo quản trong dung dịch PBS ở 40C và phải tiến hành phân lập trong vòng 48 giờ, nếu muốn bảo quản dài hơn phải giữ ở -700C.
Phương pháp phân lập virus thường sử dụng là tiêm truyền qua phôi gà 9-11 ngày tuổi hoặc môi trường dòng tế bào thận chó (MDCK).
- Phân lập virus trên phôi gà.
Sử dụng phôi gà 9-11 ngày tuổi ựể phân lập virus. Mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm cho 3 phôi và ựược ấp ở 370C trong 7 ngày.
Trước khi thu hoạch nước trứng phải cất trứng vào tủ lạnh 40C trong 4 giờ hoặc ựể ở nhiệt ựộ - 200C trong 20 phút. Nước trứng thu ựược cho vào ống nghiệm 10 ml và bảo quản trong tủ -700C.
Mẫu phân lập ựược kiểm tra bằng phản ứng HA, nếu âm tắnh có thể cấy chuyển trên phôi trứng gà thêm 2-3 lần.
- Phân lập virus trên môi trường tế bào.
để có thể gây nhiễm bệnh phẩm trên môi trường tế bào, trước tiên phải thực hiện nuôi cấy tế bào chai T-25 trong môi trường phát triển tế bào với các hóa chất, nguyên vật liệu cần thiết. Sau khi thảm tế bào mọc từ 90% trở lên sau 24-72 giờ có thể sử dụng ựể phân lập virus bằng việc gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm ựã xử lý kháng sinh hoặc qua lọc lên bề mặt tế bào. Quá trình gây nhiễm bệnh phẩm ựược bổ xung môi trường nuôi cấy virus (D - MEM với TCPK treaed trypsin) trong tủ ấm CO2. Tiến hành quan sát bệnh tắch tế bào (CPE) hàng ngày.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
Có thể thu hoạch dịch nổi trong chai tế bào ựã cấy virus sau 1-7 ngày ựể kiểm tra bằng phản ứng HA. Nếu âm tắnh có thể cấy chuyển trên tế bào thêm 2-3 lần. Mẫu phân lập trên tế bào ựược bảo quản trong tủ -700C (Trung tâm chẩn ựoán Thú y Trung ương, 2004).
* định danh virus
để ựịnh danh virus phân lập ựược có thể dùng phản ứng HI ựể giám ựịnh subtype H, NI ựể giám ựịnh subtype N hoặc dùng phản ứng RT-PCR với các cặp mồi chuẩn ựể xác ựịnh subtype H, N.
để xác ựịnh kháng thể cúm trong huyết thanh có thể dùng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI, ELISA, phản ứng khuếch tán trong thạch (AGP).