3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.4 đánh giá kiểu gen
3.2.4.1 Chiết suất ADN
Chiết suất ADN theo phương pháp của Lang 2002 gồm các bước sau:
Chọn và thu mẫu lá: chọn lá khỏe, non (2cm) ựặt vào tube và ghi nhãn cẩn thận. đậy tube và ựặt tube vào thùng ựá giữ lạnh.
Giữ nhiệt ựộ phòng, cắt nhỏ lá và ựặt vào ựĩa (Spot test).
Thêm vào 400ộl ADN extraction buffer. Nghiền các mô lá với ựũa thủy tinh ựến khi có màu xanh (ựây là dấu hiệu tế bào bị vở và phóng thắch ra
diệp lục). Dụng cụ này phải ựược lau sạch và tiệt trùng trước và sau khi dùng.
Thêm 400ộl ADN extraction buffer. Trộn và chuyển 400ộl vào một tube mới với thể tắch 1,5ml ựã ựược ghi nhãn với ký hiệu câỵ
Thêm 400ộl chloroform. Trộn cẩn thận rồi ựặt tube vào máy ly tâm khoảng 30 giâỵ Chuyển dung dịch trong phắa trên sang một tube mới (thể tắch 1,5ml, ựã ựược ghi nhãn với ký hiệu cây). Giai ựoạn này cần có sự cẩn thận ựể tránh sự trộn lẫn dung dịch bên ựáy của tubẹ
Thêm vào 800ộl cồn 100% và trộn ựềụ Tiếp tục ly tâm trong thời gian 3 - 5 phút. đổ bỏ phần dung dịch (supernatant).
Rửa phần tủa (pellet) với cồn 70%.
Phơi khô ADN (khoảng 2 giờ ở nhiệt ựộ phòng).
Hòa ADN vào 50 ộl TE, giữ ở nhiệt ựộ -20ồC.
Dùng khoảng 1 ộl ADN cho một phản ứng PCR.
Chú ý: để ựảm bảo mẫu không có sự tạp nhiễm, dụng cụ phải ựược rửa thật sạch và hấp khử trùng trước khi sử dụng, ựeo găng tay và lau thật kỹ khu vực làm việc bằng cồn 70o trước khi bắt ựầu làm việc.
3.2.4.2 đánh giá số lượng ADN bằng phương pháp ựiện di
Chuẩn bị gel agarose
- Pha dung dịch 1X TAE và rót vào hộp ựiện di
- đo kắch thước khay và tắnh toán thể tắch gel cần nấu
- Lấy 250 ml dung dịch 1X TAE ựã tắnh ựể pha nồng ựộ agarose gel 0,9%. - đun sôi dung dịch agarose trong lò vi sóng (microwave) ựến khi tan hoàn toàn và ựúng thể tắch.
- Làm nguội dung dịch agarose trên máy lắc ựến nhiệt ựộ khoảng 55oC, sau ựó tiến hành rót nhẹ nhàng vào khay ựiện di (chú ý tránh bọt khắ).
- Chờ ựến khi gel cứng khoảng 1 giờ sau khi ựổ lúc ựó tiến hành load mẫụ
Load mẫu
Chuẩn bị mẫu ADN cho loading: 8ộl ADN + 4ộl dung dịch nhuộm (loading buffer).
Nhuộm mẫu
- Sau khi chạy ựiện di xong thì mẫu ựược ngâm trong dung dịch Ethidium bromide trong 20-30 phút (dung dịch Ethidium bromide ựược pha với 100ộl/50 ml nước cất).
- Sau khi ngâm xong, vớt gel ra và ngâm trong dung dịch nước cất khoảng 30 giây và ựem chụp hình dưới tia UV.
- Dựa trên band hình xuất hiện ADN mà ựánh giá số lượng ADN.
3.2.4.3 Chạy PCR:
+ Chuẩn bị dung dịch cho PCR cho một phản ứng như sau:
Bảng 3.4: Các thành phần pha dung dịch PCR cho 1 phản ứng
Thành phần Pha dung dịch Thể tắch (ộl) Nồng ựộ sau cùng
H2O 12,5
PCR buffer 10X 2 1X
DNTP 1Mm 2 100ộl
Mồi xuôi 5ộM 1 0,25ộM
Mồi ngược 5ộM 1 0,25ộM
Taq polymeraz 5unit/ộl 0,5 2,5U/20ộl
DNA 25ng/ộl 1 1,25ng/ộlộl
Tổng cộng 20ộl ộl
+ Các bước tiến hành chạy PCR:
- Các thành phần dung dịch thường ựặt trong tủ lạnh -20ồC và -80ồC - Ghi nhãn cẩn thận trên tube 1.5 ml dùng cho PCR.
- Trộn ựều và li tâm.
- Dùng pipet lấy 19ộl cho vào mỗi tube có chứa ADN.
- Nhỏ một giọt dầu phủ trên dung dịch. Sau ựó, ựem các tube ly tâm. - đặt các tube vào máy PCR và cho máy hoạt ựộng.
Bảng 3.5: Chu trình hoạt ựộng của máy như sau:
Giai ựoạn 1 Giai ựoạn 2 Giai ựoạn 3 Chương trình Nhiệt ựộ Thời gian Nhiệt ựộ Thời gian Nhiệt ựộ Thời gian Số chu kỳ 1 94ồC 5 phút 2 94ồC 1 phút 55ồC 1 phút 72ồC 2 phút 35 3 72ồC 5 phút 4 4ồC 5 phút
- Lấy mẫu ra khi hoàn thành các chu kỳ. - Trữ ở nhiệt ựộ 4ồC.
- Chuẩn bị gel agarose 3%.
- Dùng 8 Ờ 10 ộl sản phẩm PCR cộng với 2 Ờ 4 ộl loading buffer cho vào mỗi lỗ giếng.
- Chạy ựiện di nằm khoảng 1.5 Ờ 2 giờ.
+ Kiểm tra sản phẩm PCR
- Chuẩn bị gel agarose 3% với dung dịch ựệm TBE 1X dược pha ra từ TAE 10X
- Dùng 7 ộl sản phẩm PCR cộng với 4 ộl dung dịch nhuộm cho vào mỗi giếng.
- điện di trong 1 giờ
- Nhuộm với Ethidium bromide và mang gel chụp ảnh dưới tia UV - Dựa vào band hình xuất hiện tìm gen kháng và nhiễm rầy nâụ
Thực hiện phản ứng PCR với SSR marker
- Với kỹ thuật PCR, người ta có thể tìm kiếm những gen kháng chắnh, nhờ kỹ thuật phân tắch dựa vào marker phân tử hay ựược gọi là MAS (Marker
Associate Selection). Mặc khác, theo Bùi Chắ Bửu và Nguyễn Thị Lang (2007) gen kháng có chuỗi mã di truyền mang tắnh chất bảo thủ có thể ựược phân lập bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR, Số lượng ADN cần cho một phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5-10 ng ADN thuần khiết là ựủ ựể cho kết quả theo mong muốn (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chắ Bửu, 2005).
- Trong phản ứng PCR SSR nồng ựộ ADN ựược pha loãng ựến 20 - 50 ng/ộl cho phù hợp với lượng ADN cần thiết ựể thực hiện phản ứng PCR.
- để ựánh giá sự ựa hình của các gen kháng trên các tổ hợp lai, 2 primer ựược sử dụng ựó là primer VL3và VL4 nằm trên nhiễm sắc thể số 12.
- Dùng SSR marker ựịnh vị trên gen kháng rầy nâu giúp ựánh giá sự liên kết gen, sự hiện diện của gen kháng rầy nâu trên các tổ hợp
Chuỗi mã di truyền của VL3 và VL4
VL3: 5ỖCCGAGACAAGCTGTGACGCT3Ỗ VL4: 5ỖACATTAGGGCCATGTTCCTCG3Ỗ ♦ Chọn marker chuẩn
để tách những ựoạn DNA nhỏ người ta dùng các marker chuẩn: Φ 174 marker
Dùng Φ marker 174 cắt ựoạn với các kắch thước nhỏ nhờ Hinf I :100, 200, 300, 400, 500, 6090, 700, 800, 900 1000 và 1500 bp.
Hình 3.11: ΦΦΦ 174 marker cắt bởi enzyme Φ Hinf I ựược tách trên gel agarose