Nguyên tắc cơ bản của PCR: Phản ứng chuỗi polymerase thường ựược viết tắt là PCR (polymerase chain reaction). đây là phương pháp nhân nhanh một ựoạn ADN trong ống nghiệm ra ựời từ ựầu thập niên 1990 cho phép chúng ta ứng dụng marker phân tử theo hướng ựơn giản và hiệu quả hơn. Phương pháp PCR tạo nên ALP (amplicon length polymorphism) phản ánh ADN có tắnh ựa hình giữa các cá thể, các dòng lai và giữa các giống trên cơ sở ựiện dị Ngoài ra, PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hóa di
truyền ADN bằng cách phát triển primer một cách ựồng loạt trên các dây ựơn ADN. Toàn bộ tiến trình ựược hoàn thiện do sự biến chất của ADN cần thiết, sự tác ựộng của primer tại ựầu của các dây ựơn ADN này, kế ựến là sự phát triển của các primer do phản ứng ADN polymerasẹ
Bước 1: Giai ựoạn biến tắnh thường là 94 - 96ồC trong vòng 30 giây -1 phút (tùy thuộc vào vật liệu).
Bước 2: Giai ựoạn bắt cặp thường nhiệt ựộ dao ựộng khoảng 40-72ồC thường là 55ồC và kéo dài từ 30 giây -1 phút.
Bước 3: Giai ựoạn tổng hợp hay kéo dài lúc này nhiệt ựộ tăng lên ựến 72ồC, ựây là nhiệt ựộ tối ưu cho nhiều ADN polymerase chịu nhiệt và kéo dài từ 1 phút ựến nhiều phút tùy vào ựộ dài ADN cần khuếch ựạị
Chu kỳ gồm 3 bước này sẽ ựược lặp lại nhiều lần khoảng 25 - 40 (tùy vào ứng dụng chuyên biệt). Cuối cùng ựược kết thúc bằng một ỘextensionỢ ở 72ồC trong 5 phút, sau ựó cho dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt ựộ phòng hoặc ở 4ồC (tùy thuộc vào loại máy Thermal cycler ựược sử dụng) (Bùi Chắ Bửu & Nguyễn Thị Lang, 2004). Số bản sao ADN ựược tạo ra nhờ kỹ thuật PCR ựược tắnh như sau:
Tổng số khuếch ựại = m x 2n
Trong ựó n là số chu kỳ, m là số bản sao của chuỗi mã cần nghiên cứu (Bùi Chắ Bửu & Nguyễn Thị Lang, 2004).
Một số thành phần chủ yếu trong hỗn hợp phản ứng PCR:
Ớ ADN polymerase ựược dùng phổ biến là Taq polymerase lấy từ Thermus aquaticus, có tắnh ổn ựịnh nhiệt rất caọ Taq polymerase nhạy cảm với ion magnesium. Nồng ựộ tối hảo của Mg++ là 0,5-2,5 mM. Vì dNTP có thể gắn với ion Mg++, cho nên nồng ựộ chắnh xác của Mg tùy thuộc vào nồng ựộ của dNTP.
Ớ Các thành phần khác ắt mẫn cảm với Taq polymerase là KCl và Tris. Ngoài ra, các chất tẩy không có ion, gelatine, NP40 và Tween 20 ựược thêm vào với số lượng nhỏ nhằm thúc ựẩy hoạt ựộng của Taq polymerase với nồng ựộ hiện ựược dùng là 0,01% và còn tiếp tục thử nghiệm. Trong hầu hết các quy trình, người ta khuyến cáo nồng ựộ Taq sử dụng là 0,5U/25ộl. Nếu nồng ựộ Taq quá cao (> 1,25U/25ộl) những sản phẩm không chuyên tắnh có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả. Nếu nồng ựộ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có ựủ số lượng men xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn (Bùi Chắ Bửu & Nguyễn Thị Lang, 2004).
Ớ Primer và dNTP: Dung dịch dNTP làm stock phải ựược trung tắnh ở pH=7.0. Stock ban ựầu ựược pha thêm ựể có 10 mM, và tồn trữ ở -200ồC. Stock ựược dùng nên có nồng ựộ dNTP là 1mM. Sự ổn ựịnh của dNTP trong suốt các chu kỳ lặp lại ước còn khoảng 50% sau 50 chu kỳ. Hàm lượng dNTP trong khoảng 20-200ộM cho kết quả ổn ựịnh, trung thực và chuyên tắnh. Bốn dNTP ựược xử lý sao cho nồng ựộ chúng tương ựương nhau, ựể giảm thiểu tối ựa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào ựó.
Sự khuếch ựại chuyên biệt ựối với ADN cần nghiên cứu ựều phải tùy thuộc các primer tương xứng. Do vậy, chiều dài primer và thành phần G + C ựều có ảnh hưởng quan trọng ựối với nhiệt ựộ trong quá trình tác ựộng ở ựầu dây ựơn. Nếu có 50% G+C, thì chiều dài của primer phải có kắch thước tương ứng là 18 Ờ 20 nucleotide và có tắnh ựặc hiệu hơn, còn ựối với primer chứa một ựoạn lớn hơn 4 nucleotide liên tục thì nó sẽ làm mất tắnh ựặc hiệụ
Ớ ADN mục tiêu: Người ta cần phải có những ựoạn ADN mang mật mã biết trước, ựược gọi với thuật ngữ ADN mục tiêụ Trong kỹ thuật PCR, kết quả thu nhận sẽ tốt nhất nếu ADN thật sự thuần khiết. Số lượng ADN cần cho một phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5-10 ng DNA thuần khiết.
