gen VT1, VT2 và eae
Thành phần Thể tắch (ộộộộl) Nồng ựộ
Mồi xuôi 1+1+1 3,2 ộM /ộl
Mồi ngược 1+1+1 3,2 ộM /ộl
Dung dịch ựệm AMP x 5 (Fermentas) gồm: + 750 mM Tris - HCl (pH=8) + 200 mM (NH4)2SO4 + 0,1% (v/v) Tween 20 + dNTPs + 2 mM MgCl2 5 -
Taq Ờ polymerase (Fermentas) 0,62 ộl 500 UI(1U/1
ộl)
DNA mẫu thắch hợp
Nước khử ion vừa ựủ 25 ộl -
Tổng cộng 25 ộl -
- Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR:
Bảng 2.3: Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng ựể xác ựịnh gen VT1, VT2 và eae
Các giai ựoạn của phản ứng Nhiệt ựộ
(oC)
Thời gian (phút)
Số chu kỳ
Giai ựoạn tiền biến tắnh 94 5 1
Giai ựoạn biến tắnh Giai ựoạn bắt cặp Giai ựoạn tổng hợp 94 50 72 1 1 1 30
Giai ựoạn kéo dài 72 7 1
- Phân tắch sản phẩm: Các sản phẩm của phản ứng PCR ựược tiến hành chạy ựiện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch 1 x TAE với hiệu ựiện thế
100V trong 30 phút. đọc kết quả và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc 2000. Ảnh ựược lưu giữ lại và ựược tiến hành xử lý kết quả khi cần thiết.
2.4.3. Phương pháp xác ựịnh ựộ ựặc hiệu của phản ứng PCR
độ ựặc hiệu của phản ứng PCR ựược xác ựịnh bằng cách kiểm tra với 10 chủng VTEC ựối chứng dương và 10 chủng vi khuẩn ựối chứng âm với các thông tin về ựặc tắnh của một số yếu tố gây bệnh ựã ựược công bố (bảng 2.4a, b), sử dụng phản ứng PCR phức (mục 2.4.2.).
Bảng 2.4a: Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn E.
coli ựối chứng dương
Ký hiệu chủng đặc tắnh về một số yếu
tố gây bệnh Nơi cung cấp
E. coli FD523 VT1/VT2
E. coli FD526 VT1
E. coli FD528 VT2
Viện nghiên cứu thú y (NVRI), Ba Lan
E. coli FD635 VT1/VT2/eae/Hly
E. coli FD636 VT1/VT2/eae/Hly
Phòng thắ nghiệm tham chiếu E. coli, Tây Ban Nha (Laboratorio de Referencia de E. coli - LREC) E. coli BDL9.1 VT2 E. coli BKT29.1 VT2 E. coli E4 VT1/VT2 E. coli E7 VT1/VT2 đối chứng dương E. coli E41 VT1/VT2 Phòng thắ nghiệm tham chiếu vi khuẩn E. coli
của OIE, Canada (OIE Reference Laboratory for
Bảng 2.4b: Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn ựối chứng âm
Ký hiệu chủng đặc tắnh về một số
yếu tố gây bệnh Nơi cung cấp
E. coli (C-600) (K-12) -
E. coli FV847a F4/STa/STb/LT
E. coli FV2289 F18/STa/STb/VT2v E. coli FV2586 F4/STb/LT E. coli FV2593 F18/STa/STb/VT2v S. typhymurium (FD675) - P. multocida (PM-VT3) - S. suis (HN-25) - S. aureus (FD231) - đối chứng âm C. perfringens (BCD6) - Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y
2.4.4. Phương pháp xác ựịnh ựộ nhạy của phản ứng PCR
2.4.4.1. Phương pháp xác ựịnh ựộ nhạy của phản ứng PCR dùng ựể xác ựịnh VTEC trong môi trường nhân tạo
Tiến hành cấy 1 khuẩn lạc của mỗi chủng vi khuẩn vào lọ ựựng 20 ml môi trường (LB, m-TSB và BHI). Sau 20 giờ ủ ở 37oC, tiến hành pha loãng canh khuẩn theo cơ số 10 ựể ựược các nồng ựộ pha loãng thắch hợp (10-1, 10-2, ..., 10-8), ựếm số trên môi trường thạch máu, ựồng thời tiến hành các bước tách DNA mẫu (mục 2.4.2.) từ tất cả các nồng ựộ pha loãng (kể cả canh khuẩn ban ựầu) ựể dùng cho phản ứng PCR.
2.4.4.2. Phương pháp xác ựịnh ựộ nhạy của phương pháp PCR dùng ựể xác ựịnh VTEC trong các mẫu thịt sạch
- Chọn 3 mẫu thịt (bò, lợn, gà) ựã ựược xác ựịnh là âm tắnh trong phản ứng PCR ựể tiến hành gây nhiễm với mỗi một chủng vi khuẩn ựối chứng dương. - 25 g thịt ựã ựược cắt nhỏ và cho vào 225 ml môi trường m-TSB.
- Môi trường m-TSB ựã nuôi cấy chủng vi khuẩn ở 37oC/24 giờ. Pha loãng thành các nồng ựộ từ 10-1 ựến 10-8.
- Cho 0,4 ml canh khuẩn ở mỗi nồng ựộ pha loãng vào lọ môi trường m-TSB ựã có 25 g thịt.
- Tách DNA mẫu và tiến hành phản ứng PCR với tất cả các nồng ựộ pha loãng (kể cả canh khuẩn ban ựầu).
2.4.5. Phương pháp lấy mẫu thịt tươi từ chợ
Mẫu thịt lợn, thịt bò, thịt gà ựược mua ngẫu nhiên tại một số chợ và lò mổ trên ựịa bàn Hà nội.
Mẫu ựược lấy vào buổi sáng (6-7 giờ). Mỗi mẫu ựược ựựng riêng rẽ vào 1 túi nilon sạch, có ghi rõ ký hiệu. Các mẫu ựược bảo quản trong nhiệt ựộ lạnh (4-80C) và chuyển về phòng thắ nghiệm ựể xử lý mẫu trong cùng ngày.
2.4.6. Phương pháp lấy mẫu lau thân thịt và mẫu phân từ lò mổ
Mẫu lau thân thịt: dùng gạc tiệt trùng lau trên thân thịt sau khi ựã ựược giết mổ, tách toàn bộ nội tạng, mỗi thân thịt lau tại 3 vị trắ, 100 cm2/vị trắ. Sau khi lau, gạc ựược ựặt vào lọ có chứa 20 ml môi trường mTSB.
Mẫu phân: ựược lấy trực tiếp từ phần ruột già của gia súc tại khu xử lý nội tạng. Sử dụng túi nilon ựã tiệt trùng bằng tia UV ựể ựựng mẫu.
2.4.7. Phương pháp phân lập và giám ựịnh vi khuẩn VTEC
Từ các mẫu thu thập ựược, chúng tôi tiến hành phân lập và giám ựịnh vi khuẩn VTEC theo quy trình tham khảo của FDA (US Food and Drug
Administration) và Phòng Thắ nghiệm tham chiếu vi khuẩn E. coli của OIE, Canada (Université de Montréal, Canada).
Quy trình này ựược thể hiện bằng hình 2.1 như sau:
370C/ qua
370C/ qua ựêm Mẫu
(thịt tươi, lau thân thịt, phân)
Tăng sinh - 25 g thịt + 225 ml m-TSB
- Gạc lau thân thịt ựặt trong lọ có 20 ml m-TSB - 0,5 g phân + 10 ml m-TSB
100 ộl canh khuẩn cấy lên thạch MacConkey
Chọn 3 khuẩn lạc ựiển hình /mẫu (khuẩn lạc màu hồng cánh sen)
PCR Âm tắnh Dương tắnh PCR cho từng khuẩn lạc Âm tắnh Dương tắnh định typ Giữ giống 370C/ qua ựêm
2.4.8. Phương pháp xác ựịnh typ kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn phân lập ựược
được thực hiện theo phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kắnh như Sojka và cs (1965) mô tả. Các chủng vi khuẩn ựược tiến hành xác ựịnh nhóm với huyết thanh ựa giá trước, sau ựó ựến các huyết thanh ựơn giá trong nhóm.
* Chuẩn bị
- Các chủng vi khuẩn VTEC cần ựịnh typ ựược cấy trên thạch máu cừu, ủ ở tủ ấm 370C trong 18-24 giờ.
- Các kháng huyết thanh O chuẩn (ựa giá và ựơn giá) - Nước muối sinh lý 0,9%; phiến kắnh sạch, que cấy nhựa
* Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh
Nhỏ lên phiến kắnh sạch, mỗi ựầu một giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc VTEC cần xác ựịnh trộn ựều với 2 giọt nước muối sinh lý ựể tạo thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn vào một bên huyễn dịch và một giọt nước muối sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (ựối chứng). Hiện tượng ngưng kết (nếu có) sẽ xuất hiện trong vòng 30 giây, hỗn dịch xuất hiện những hạt nhỏ trắng lấm tấm, tách ra làm hai phần gồm các hạt ngưng kết và phần nước trong. Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì ựược ựánh giá ở mức ++++. Tùy theo khả năng ngưng kết, có thể ựánh giá ngưng kết ở các mức ựộ khác nhau (+, ++, +++). Phản ứng là âm tắnh khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh ựục ựều như bên ựối chứng.
Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh ựa giá, thực hiện tiếp với các kháng huyết thanh ựơn giá thuộc nhóm ựể xác ựịnh rõ từng typ.
Trong trường hợp chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc với nhiều ựơn giá khác nhau hoặc chủng không ngưng kết với tất cả các nhóm kháng huyết thanh ựa giá, khuẩn lạc của chủng vi khuẩn ựó ựược lấy
vào 1 eppendorf ựã có 200 ộl nước muối sinh lý, ựun ở 1000C trong 30 phút, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, lấy cặn và tiến hành lại phản ứng ngưng kết.
Những chủng cho kết quả âm tắnh với tất cả các nhóm kháng huyết thanh ựa giá (kể cả sau khi ựã tiến hành ựun và ly tâm như trên) ựược kết luận là ỘKhông xác ựịnhỢ.
2.4.9. Xử lý số liệu
Các số liệu ựược xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng chương trình Excel.
PHẦN III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Với những trường hợp bệnh ở người và ựộng vật có liên quan tới VTEC, trong ựó có cả những bệnh gây nguy hiểm tới tắnh mạng con người như hội chứng huyết niệu (HUS), thực tế ựòi hỏi phải có một phương pháp nhạy và ựặc hiệu nhằm phát hiện vi khuẩn này. Trong ựó, PCR ựã và ựang ựược ựánh giá là phương pháp chắnh xác, nhanh và tiện dụng nhất ựể phát hiện các mẫu thực phẩm hoặc mẫu phân có chứa VTEC thông qua xác ựịnh gen quy ựịnh các yếu tố ựộc lực của vi khuẩn này (Paton A. W. và J. C. Paton, 2002). Tuy nhiên, hiện nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào khẳng ựịnh cũng như chưa có những nghiên cứu cụ thể ựể thiết lập và chuẩn hóa quy trình xác ựịnh VTEC trong thịt bằng PCR.
3.1. Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR
3.1.1. Lựa chọn giữa PCR ựơn và PCR phức
Phản ứng PCR ựơn mồi ựã ựược nhiều tác giả nghiên cứu và thiết lập ựể xác ựịnh sự có mặt của vi khuẩn VTEC (Helge Karch và Thomas Meyer, 1989; Oswald E. và cs, 2000). Tuy nhiên, phương pháp này ựòi hỏi một số lượng lớn phản ứng PCR ựể có thể xác ựịnh ựược các ựặc tắnh của VTEC.
Với mục ựắch tiết kiệm chi phắ, thời gian và sức lao ựộng, các phản ứng PCR ựa mồi cần thiết ựể chẩn ựoán VTEC ựã ựược nghiên cứu và áp dụng (Paton A. W. và J. C. Paton, 2002).
độc lực của VTEC gồm nhiều yếu tố khác nhau, trong ựó hai yếu tố ựộc lực chắnh là ựộc tố verocytotoxin (VT1 và VT2). Hai loại ựộc tố này gây ra một số thể bệnh ở những người bị nhiễm, từ thể bệnh tiêu chảy nhẹ ựến những thể bệnh nặng hơn như tiêu chảy có lẫn máu, viêm ruột xuất huyết, hội chứng huyết niệu, viêm màng não,...( Paton A. W. và J. C. Paton, 2002). Bên cạnh ựó, intimin cũng ựược coi là một yếu tố ựộc lực của VTEC vì là yếu tố hỗ trợ cho quá trình sản sinh ựộc tố. Intimin có bản chất là protein, mã hóa bởi gen eae, giúp cho quá trình VTEC gắn vào tế bào biểu mô ruột, gây nên
bệnh tắch bám dắnh và xâm nhập (A/E) ở niêm mạc ruột. Mối liên quan giữa việc nhiễm các chủng VTEC có khả năng sản sinh intimin và các trường hợp bệnh nặng ở người cũng ựã ựược chứng minh (Jorge Blanco và cs, 2007).
Hai loại ựộc tố VT và yếu tố intimin có liên quan mật thiết tới khả năng gây bệnh của vi khuẩn E. coli, trong ựó gen VT mã hóa cho ựộc tố VT, là nguyên nhân gây hội chứng huyết niệu trên các bệnh nhân, còn gen eae mã hóa cho yếu tố bám dắnh intimin Ờ là yếu tố then chốt giúp cho vi khuẩn tấn công qua niêm mạc ựường tiêu hóa.
Theo ựó, trong nghiên cứu này, chúng tôi ựã xây dựng một phương pháp PCR ựa mồi nhằm xác ựịnh 3 loại gen ựộc lực của các chủng VTEC ựối chứng, từ ựó áp dụng ựối với các chủng phân lập ựược, lần lượt là gen VT1 mã hóa cho ựộc tố VT1, gen VT2 mã hóa cho ựộc tố VT2 và gen eae mã hóa cho yếu tố intimin.
Thắ nghiệm ựược tiến hành với 3 chủng vi khuẩn, gồm 2 chủng ựối chứng dương (FD523, FD636) và 1 chủng ựối chứng âm (C-600). DNA mẫu là một lượng nhỏ khuẩn lạc của vi khuẩn ựã ựược nuôi cấy trên ựĩa thạch máu cừu (370C/24 giờ).
Ban ựầu, phản ứng PCR ựơn ựược thực hiện với từng cặp mồi riêng biệt, sau ựó, phản ứng PCR phức ựược thực hiện với sự phối hợp ựồng thời của 3 cặp mồi. Kết quả ựược thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR ựơn và ựa mồi ựể phát hiện một số gen ựộc lực của VTEC
PCR ựơn mồi PCR ựa mồi
Các chủng kiểm tra
VT1 VT2 eae VT1 VT2 eae
FD523 + + - + + -
FD636 + + + + + +
Kết quả cho thấy: Phản ứng PCR phức với cả 3 loại cặp mồi ựều cho các sản phẩm riêng biệt và ổn ựịnh như trong phản ứng với từng cặp mồi riêng biệt. Ngoài ra, phản ứng PCR phức còn thể hiện một số ưu ựiểm khác: tiết kiệm thời gian, công lao ựộng, và ựặc biệt là tiêu hao vật tư, hóa chất cho 1 phản ứng cũng giảm ựáng kể. Do ựó, ựể xác ựịnh vi khuẩn VTEC trong thịt nên sử dụng phản ứng PCR phức hay PCR ựa mồi.
3.1.2. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thắch hợp ựể tách chiết DNA mẫu
Mặc dù việc kiểm tra trực tiếp mẫu phân hoặc mẫu thực phẩm hoàn toàn có thể thực hiện ựược, nhưng ựể thu ựược kết quả tốt nhất, nên nuôi cấy tăng sinh mẫu trong một môi trường thắch hợp, sau ựó sử dụng canh khuẩn ựó làm mẫu DNA cho phản ứng PCR (Gannon và cs, 1992; Paton và cs, 1993; Begum và Jackson, 1995; Paton và Paton, 1998, 2002). Việc lựa chọn một loại môi trường thắch hợp, vừa có tác dụng tăng sinh vi khuẩn từ mẫu ban ựầu, vừa có thể ựược sử dụng trực tiếp ựể tách DNA cho phản ứng PCR là việc làm cần thiết, có ý nghĩa quan trọng ựối với việc kiểm tra chất lượng vi sinh của thực phẩm, ựặc biệt là trong trường hợp các mẫu là thực phẩm chắn và cần phải trả lời kết quả ngay trong thời gian ngắn.
Thắ nghiệm ựược tiến hành với 3 chủng vi khuẩn, gồm 2 ựối chứng dương (FD523, FD636) và 1 ựối chứng âm (C-600).
Vi khuẩn ựược nuôi cấy trên 5 loại môi trường lỏng (LB, m-TSB, BHI, BPW và NB) và thạch máu. Ủ ở tủ ấm 370C qua ựêm.
Sau ựó, phản ứng PCR ựược tiến hành như ựã trình bày ở mục 2.4.2. Kết quả như sau:
+ đối với chủng ựối chứng dương (FD523, FD636): DNA ựược tách chiết từ các chủng vi khuẩn nuôi cấy trên các loại môi trường khác nhau ựều cho kết quả tương ựương
Bảng 3.2: Kết quả xác ựịnh môi trường thắch hợp nuôi cấy vi khuẩn ựể chiết tách DNA cho phản ứng PCR
Kết quả phản ứng PCR Vi khuẩn ựối chứng
dương Vi khuẩn ựối chứng âm
Số lần thắ nghiệm Loại môi trường nuôi cấy FD523 FD636 C-600 LB + + - m-TSB + + - BHI + + - BPW + + - 2 NB + + -
Như vậy, có thể thấy: cả 5 loại môi trường lỏng ựều không gây ảnh hưởng ựến chất lượng và kết quả của phản ứng PCR. Tuy nhiên, khi tiến hành so sánh và phân tắch thêm một số chỉ tiêu khác (chất lượng môi trường ảnh hưởng tới mức ựộ tăng sinh của vi khuẩn, giá thành, tác ựộng tới môi trường, ...), chúng tôi ựã quyết ựịnh lựa chọn môi trường m-TSB là môi trường tăng sinh thắch hợp ban ựầu cho việc kiểm tra sự có mặt của nhóm vi khuẩn VTEC ựối với các mẫu thịt tươi. Riêng ựối với vi khuẩn ựã ựược nuôi cấy lên môi trường thạch máu, cũng có thể sử dụng trực tiếp cho phản ứng PCR, không cần chiết tách và không làm ảnh hưởng tới chất lượng phản ứng.
3.1.3. Kết quả thực hiện phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn ựối chứng
Kết quả thực hiện phản ứng PCR phức ựã ựược chuẩn hóa dùng ựể xác ựịnh 3 gen (VT1, VT2 và eae) với 10 chủng ựối chứng dương và 10 chủng ựối chứng âm ựược trình bày ở bảng 3.3a và 3.3b.
Như vậy, có thể kết luận: phản ứng PCR ựã ựược chuẩn hóa trong nghiên cứu này dùng ựể xác ựịnh 3 loại gen có ựộ ựặc hiệu là 100% khi ựược xem xét thử nghiệm trên các chủng ựối chứng.
Hình 3.1: Các sản phẩm của phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn ựối chứng dương và âm sau quá trình ựiện di
Ghi chú: M: 100 bp marker. Giếng 1: FD523 (VT1/VT2). Giếng 2: FD526 (VT1).
Giếng 3: FD528 (VT2). Giếng 4: FD635 (VT1/VT2/eae). Giếng 5: FD636 (VT1/VT2/eae). Giếng 6: BDL9.1 (VT2). Giếng 7: BKT29.1(VT2). Giếng 8: E4 (VT1/VT2). Giếng 9: E7 (VT1/VT2). Giếng 10: E41 (VT1/VT2). Giếng 11, 12, 13, 14, 15: Các chủng ựối chứng âm.
Bảng 3.3a: Kết quả thực hiện phản ứng PCR phức ựể phát hiện các chủng vi khuẩn ựối chứng dương
Một số yếu tố gây bệnh Ký hiệu chủng VT1 VT2 eae E. coli FD523 + + - E. coli FD526 + - - E. coli FD528 - + -