Mặc dù việc kiểm tra trực tiếp mẫu phân hoặc mẫu thực phẩm hoàn toàn có thể thực hiện ựược, nhưng ựể thu ựược kết quả tốt nhất, nên nuôi cấy tăng sinh mẫu trong một môi trường thắch hợp, sau ựó sử dụng canh khuẩn ựó làm mẫu DNA cho phản ứng PCR (Gannon và cs, 1992; Paton và cs, 1993; Begum và Jackson, 1995; Paton và Paton, 1998, 2002). Việc lựa chọn một loại môi trường thắch hợp, vừa có tác dụng tăng sinh vi khuẩn từ mẫu ban ựầu, vừa có thể ựược sử dụng trực tiếp ựể tách DNA cho phản ứng PCR là việc làm cần thiết, có ý nghĩa quan trọng ựối với việc kiểm tra chất lượng vi sinh của thực phẩm, ựặc biệt là trong trường hợp các mẫu là thực phẩm chắn và cần phải trả lời kết quả ngay trong thời gian ngắn.
Thắ nghiệm ựược tiến hành với 3 chủng vi khuẩn, gồm 2 ựối chứng dương (FD523, FD636) và 1 ựối chứng âm (C-600).
Vi khuẩn ựược nuôi cấy trên 5 loại môi trường lỏng (LB, m-TSB, BHI, BPW và NB) và thạch máu. Ủ ở tủ ấm 370C qua ựêm.
Sau ựó, phản ứng PCR ựược tiến hành như ựã trình bày ở mục 2.4.2. Kết quả như sau:
+ đối với chủng ựối chứng dương (FD523, FD636): DNA ựược tách chiết từ các chủng vi khuẩn nuôi cấy trên các loại môi trường khác nhau ựều cho kết quả tương ựương
Bảng 3.2: Kết quả xác ựịnh môi trường thắch hợp nuôi cấy vi khuẩn ựể chiết tách DNA cho phản ứng PCR
Kết quả phản ứng PCR Vi khuẩn ựối chứng
dương Vi khuẩn ựối chứng âm
Số lần thắ nghiệm Loại môi trường nuôi cấy FD523 FD636 C-600 LB + + - m-TSB + + - BHI + + - BPW + + - 2 NB + + -
Như vậy, có thể thấy: cả 5 loại môi trường lỏng ựều không gây ảnh hưởng ựến chất lượng và kết quả của phản ứng PCR. Tuy nhiên, khi tiến hành so sánh và phân tắch thêm một số chỉ tiêu khác (chất lượng môi trường ảnh hưởng tới mức ựộ tăng sinh của vi khuẩn, giá thành, tác ựộng tới môi trường, ...), chúng tôi ựã quyết ựịnh lựa chọn môi trường m-TSB là môi trường tăng sinh thắch hợp ban ựầu cho việc kiểm tra sự có mặt của nhóm vi khuẩn VTEC ựối với các mẫu thịt tươi. Riêng ựối với vi khuẩn ựã ựược nuôi cấy lên môi trường thạch máu, cũng có thể sử dụng trực tiếp cho phản ứng PCR, không cần chiết tách và không làm ảnh hưởng tới chất lượng phản ứng.
3.1.3. Kết quả thực hiện phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn ựối chứng
Kết quả thực hiện phản ứng PCR phức ựã ựược chuẩn hóa dùng ựể xác ựịnh 3 gen (VT1, VT2 và eae) với 10 chủng ựối chứng dương và 10 chủng ựối chứng âm ựược trình bày ở bảng 3.3a và 3.3b.
Như vậy, có thể kết luận: phản ứng PCR ựã ựược chuẩn hóa trong nghiên cứu này dùng ựể xác ựịnh 3 loại gen có ựộ ựặc hiệu là 100% khi ựược xem xét thử nghiệm trên các chủng ựối chứng.
Hình 3.1: Các sản phẩm của phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn ựối chứng dương và âm sau quá trình ựiện di
Ghi chú: M: 100 bp marker. Giếng 1: FD523 (VT1/VT2). Giếng 2: FD526 (VT1).
Giếng 3: FD528 (VT2). Giếng 4: FD635 (VT1/VT2/eae). Giếng 5: FD636 (VT1/VT2/eae). Giếng 6: BDL9.1 (VT2). Giếng 7: BKT29.1(VT2). Giếng 8: E4 (VT1/VT2). Giếng 9: E7 (VT1/VT2). Giếng 10: E41 (VT1/VT2). Giếng 11, 12, 13, 14, 15: Các chủng ựối chứng âm.
Bảng 3.3a: Kết quả thực hiện phản ứng PCR phức ựể phát hiện các chủng vi khuẩn ựối chứng dương
Một số yếu tố gây bệnh Ký hiệu chủng VT1 VT2 eae E. coli FD523 + + - E. coli FD526 + - - E. coli FD528 - + - E. coli FD635 + + + E. coli FD636 + + + E. coli BDL9.1 - + - E. coli BKT29.1 - + - E. coli E4 + + - E. coli E7 + + - đối chứng dương E. coli E41 + + - M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Bảng 3.3b: Kết quả thực hiện phản ứng PCR phức với các chủng vi khuẩn ựối chứng âm
Một số yếu tố gây bệnh Ký hiệu chủng VT1 VT2 eae E. coli (C-600) (K-12) - - - E. coli FV847a - - - E. coli FV2289 - - - E. coli FV2586 - - - E. coli FV2593 - - - S. typhymurium (FD675) - - - P. multocida (PM-VT3) - - - S. suis (HN-25) - - - S. aureus (FD231) - - - đối chứng âm C. perfringens (BCD6) - - -
3.2. Kết quả xác ựịnh ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phản ứng PCR dùng ựể xác ựịnh VTEC
Kỹ thuật PCR hiện ựang ựược ựánh giá là một phương pháp có ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu rất cao, gần 100%. Sở dĩ có ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu cao như vậy là do nguyên lý của PCR sử dụng cặp mồi gắn ựặc hiệu vào ựoạn DNA ựắch. Khi thực hiện phản ứng PCR, người ta nhận thấy ựộ nhạy của phản ứng cũng chắnh là giới hạn phát hiện của phản ứng. Giới hạn này chắnh là nồng ựộ của ựoạn DNA ựắch trong hỗn hợp phản ứng. Bên cạnh ựó, ựộ ựặc hiệu của phản ứng PCR là ựộ ựặc hiệu của các cặp mồi sử dụng. Cặp mồi phải ựược lựa chọn sao cho có khả năng ghép cặp tốt với trình tự ở 2 ựầu của ựoạn DNA ựắch. Kết quả xác ựịnh ựộ ựặc hiệu ghi nhận ựược còn cho thấy ựoạn DNA ựắch ựược lựa chọn ựể khuếch ựại có trình tự các nucleotide trong ựoạn gen
tương ựối ổn ựịnh và xuất hiện với tần số cao ở các chủng vi khuẩn cần nghiên cứu nhưng lại không thấy ở các chủng vi khuẩn khác.
Trong nghiên cứu này, sau khi ựã phát triển và hoàn thiện quy trình tách DNA của các chủng vi khuẩn ựối chứng, chúng tôi ựã ựánh giá ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phản ứng PCR trong môi trường nhân tạo và trên các mẫu thịt sạch.
Kết quả cụ thể ựược trình bày ở các phần sau ựây:
3.2.1. Kết quả xác ựịnh ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phản ứng PCR dùng ựể xác ựịnh VTEC trong môi trường nhân tạo
để xác ựịnh ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phản ứng PCR, trước hết cần xác ựịnh ựược số lượng vi khuẩn trên một số môi trường nuôi cấy, từ ựó lựa chọn ựược môi trường thắch hợp ựể nhân số lượng vi khuẩn và tách DNA cho phản ứng PCR. Ngoài ra, thắ nghiệm này cũng giúp lựa chọn ựược môi trường tăng sinh thắch hợp cho việc xác ựịnh VTEC trong thịt.
Thắ nghiệm ựược tiến hành như sau: Cấy 1 khuẩn lạc của chủng vi khuẩn ựối chứng dương (FD523, FD636) vào mỗi lọ ựựng 20 ml môi trường (LB, m-TSB và BHI). Sau 20 giờ ủ ở 370C, tiến hành pha loãng canh khuẩn theo cơ số 10 ựể ựược các nồng ựộ pha loãng thắch hợp (10-1, 10-2, ....,10-8), ựếm số trên môi trường thạch máu, ựồng thời tiến hành các bước tách DNA mẫu (mục 2.4.2) từ tất cả các nồng ựộ pha loãng (kể cả canh khuẩn ban ựầu) ựể dùng cho phản ứng PCR.
3.2.1.1. Kết quả xác ựịnh môi trường tăng sinh thắch hợp ban ựầu ựể kiểm tra sự có mặt của VTEC trong các mẫu thịt tươi
Kết quả ựếm số lượng vi khuẩn trong ba loại môi trường nuôi cấy ựược thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4: Kết quả ựếm số hai chủng vi khuẩn ựối chứng dương trên một số môi trường nuôi cấy
Số lượng vi khuẩn ( x 106) Số lần
TN Môi trường nuôi cấy Chủng FD523 Chủng FD636
BHI 2375,2 2508,3
LB 622,5 570,4
3
m-TSB 660,3 657,5
Hình 3.2: Kết quả ựếm số chủng FD636 trên thạch máu
(lần lượt ở các ựộ pha loãng 10-8, 10-7 và 10-6)
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, số lượng hai chủng vi khuẩn ựối chứng là tương ựương nhau ở cả 3 loại môi trường, trong ựó môi trường BHI cho kết quả cao nhất (2300 Ờ 2500 x 106 vi khuẩn/ml), sau ựó ựến môi trường m-TSB với số lượng vi khuẩn ựếm ựược khoảng 660 x 106 trong 1 ml môi trường nuôi cấy và thấp nhất là môi trường LB.
điều này chứng tỏ BHI là môi trường có dinh dưỡng tốt nhất cho nuôi cấy vi khuẩn VTEC. Tuy nhiên, khi tiến hành so sánh và phân tắch thêm một số chỉ tiêu khác (chất lượng môi trường ảnh hưởng tới mức ựộ tăng sinh của vi khuẩn, giá thành, tác ựộng tới môi trường, ...), chúng tôi ựã quyết ựịnh lựa chọn môi trường m-TSB là môi trường tăng sinh thắch hợp ban ựầu cho việc kiểm tra sự có mặt của nhóm vi khuẩn VTEC ựối với các mẫu thịt tươi.
Trong thành phần môi trường m-TSB có bổ sung thêm Novobiocin, có tác dụng ức chế các vi khuẩn Gram dương phát triển, nhằm tạo ựiều kiện thuận lợi cho vi khuẩn VTEC (nếu có) phát triển. Môi trường này ựã ựược một số tác giả sử dụng với mục ựắch tương tự (Alfredo và cs, 2001; Mohammad A. Islam và cs, 2008; P. Alexa và cs, 2011).
3.2.1.2. Kết quả xác ựịnh ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phản ứng PCR dùng ựể xác ựịnh VTEC trong môi trường nhân tạo
để xác ựịnh ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phương pháp PCR, chúng tôi ựã thực hiện phản ứng PCR với 3 cặp mồi ựặc hiệu với các gen VT1, VT2 và
eae theo phương pháp như ựã mô tả ở mục 2.4.2. Mẫu DNA là vi khuẩn VTEC ở tất cả các nồng ựộ pha loãng của canh trùng nuôi cấy (kể cả canh trùng ban ựầu) của 2 chủng ựối chứng dương trên 3 loại môi trường. Kết quả của phản ứng PCR ựược thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5: Kết quả xác ựịnh ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phản ứng PCR trên môi trường nuôi cấy
Kết quả của phản ứng PCR Chủng FD523 Chủng FD636 Nồng ựộ pha loãng Số lần TN LB (6,2x108 VK/ml) m-TSB (6,6x108 VK/ml) BHI (23,7x108 VK/ml) LB (5,7x108 VK/ml) m-TSB (6,5x108 VK/ml) BHI (25,1x108 VK/ml) đánh giá ựộ ựặc hiệu (%) CTBđ 2/2 + + + + + + 10-1 2/2 + + + + + + 10-2 2/2 + + + + + + 10-3 2/2 + + + + + + 10-4 2/2 + + + + + + 10-5 2/2 - - + - - + 10-6 2/2 - - - - 10-7 2/2 - - - - 10-8 2/2 - - - - 100
Ghi chú CTBđ: Canh trùng ban ựầu VK: Vi khuẩn
+: Phản ứng dương tắnh với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae -: Phản ứng âm tắnh với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae
Bảng 3.5 cho thấy: ở cả 2 chủng ựối chứng, phản ứng PCR ựều cho kết quả dương tắnh với cả 3 gen. Kết quả dương tắnh này ựược thể hiện ở canh trùng ban ựầu và các nồng ựộ pha loãng 10-1,10-2, 10-3, 10-4. Riêng ở môi trường BHI, cả hai chủng FD523 và FD63 ựều cho kết quả dương tắnh ựến nồng ựộ pha loãng 10-5. Có sự khác biệt này là do số lượng vi khuẩn trong môi trường BHI sau khi nuôi cấy 24 giờ nhiều hơn hẳn so với hai môi trường còn lại (gấp khoảng 3,5 lần). Vì vậy, với một lượng mẫu giống nhau trong thành phần của phản ứng PCR, số lượng DNA trong phản ứng thực hiện với môi trường BHI sẽ nhiều hơn, do ựó phản ứng PCR trong trường hợp này có ựộ nhạy cao hơn.
Như vậy:
- Về ựộ ựặc hiệu của phản ứng: DNA ựược tách ra từ 3 loại môi trường nuôi cấy ựều cho phản ứng PCR dương tắnh với ựộ ựặc hiệu là 100% với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae.
- Về ựộ nhạy của phản ứng: Ngưỡng giới hạn dưới (Lower limit) về số lượng của vi khuẩn VTEC ựể có thể phát hiện ựược trong một số môi trường nuôi cấy như sau:
+ Môi trường LB: 5,7 - 6,26 x 104 vi khuẩn/ml + Môi trường m-TSB: 6,5 - 6,6 x 104 vi khuẩn/ml + Môi trường BHI: 2,375 - 2,508 x 104 vi khuẩn/ml
Có thể thấy: ở cả 3 loại môi trường, ngưỡng giới hạn dưới hay mật ựộ của vi khuẩn ựể từ ựó có thể dùng ựể phát hiện ựược VTEC bằng phản ứng PCR là tương ựương nhau, khoảng 2,3 - 6,6 x 104 vi khuẩn/ml.
Trong phạm vi của nghiên cứu này, chúng tôi ựã không tiến hành pha loãng ở các nồng ựộ trung gian (10-5 và 10-6), do vậy ựã không xác ựịnh ựược với mật ựộ <2,3 x 104 vi khuẩn/ml canh trùng thì tới ngưỡng nào vẫn có thể cho kết quả dương tắnh trong phản ứng PCR, nhưng chắc chắn là ở các nồng ựộ thấp hơn ngưỡng ựó 10 lần (khoảng 2,3 x 103 vi khuẩn/ml) thì phản ứng PCR là âm tắnh. Tuy nhiên, kết quả này không có nghĩa là khi số lượng vi khuẩn ựạt tới mức 2,3-2,5 x 104 vi khuẩn/ml thì mới có thể phát hiện ựược bằng phản ứng PCR, vì lượng vi khuẩn ựược dùng cho phản ứng PCR chỉ là 2
ộl, tức là tương ựương với 46-50 vi khuẩn/phản ứng.
Trong một nghiên cứu ựược tiến hành năm 2007, tác giả Lê Thị Tuyết Trinh ựã tiến hành xác ựịnh ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phản ứng PCR nhằm hoàn thiện hệ thống PCR ựa mồi ựể xác ựịnh các E. coli gây tiêu chảy. Với các cặp mồi VT1, VT2 và eae dùng ựể xác ựịnh nhóm EHEC, tác giả ựã thu ựược kết quả về ựộ nhạy của phản ứng PCR ựa mồi là 105 vi khuẩn /ml. So sánh với kết quả nghiên cứu của chúng tôi, phản ứng PCR của chúng tôi có ựộ nhạy cao hơn do có thể phát hiện ựược số lượng 2,3 Ờ 2,5 x 104 vi khuẩn/ml.
Hình 3.3: Các sản phẩm của phản ứng PCR với các nồng ựộ pha loãng khác nhau từ môi trường LB ựã nuôi cấy chủng FD636
Ghi chú: M: 100 bp marker. Giếng 1: CTBđ. Giếng 2: nồng ựộ pha loãng 10-1 (VT1/VT2/eae). Giếng 3: nồng ựộ pha loãng 10-2 (VT1/VT2/eae). Giếng 4: nồng ựộ pha
loãng 10-3 (VT1/VT2/eae). Giếng 5: nồng ựộ pha loãng 10-4 (VT1/VT2/eae). Giếng 6: nồng ựộ pha loãng 10-5. Giếng 7: nồng ựộ pha loãng 10-6. Giếng 8: nồng ựộ pha loãng 10-7. Giếng 9: nồng ựộ pha loãng 10-8.
3.2.2. Kết quả xác ựịnh ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phương pháp PCR dùng ựể xác ựịnh VTEC trong mẫu thịt sạch
Với phương pháp ựược tiến hành như mục 2.4.4.2 ựã mô tả, chúng tôi thu ựược kết quả xác ựịnh ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phản ứng PCR trong mẫu thịt sạch như sau:
Trong ba loại mẫu thịt sạch (bò, lợn, gà), phản ứng PCR của hai chủng ựối chứng dương ựều cho kết quả như nhau. Các phản ứng PCR cho kết quả dương tắnh từ canh trùng ban ựầu ựến nồng ựộ pha loãng 10-2, từ nồng ựộ 10-3 ựến 10-8 ựều cho kết quả âm tắnh (bảng 3.6).
Bảng 3.6: Kết quả xác ựịnh ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phản ứng PCR trong mẫu thịt sạch Kết quả của phản ứng PCR FD523 (6,6 x 108 VK/ml) FD636 (6,2 x 108 VK/ml) Nồng ựộ pha loãng (m-TSB) Số lần TN Lợn Bò Gà Lợn Bò Gà đánh giá ựộ ựặc hiệu (%) CTBđ 2/2 + + + + + + 10-1 2/2 + + + + + + 10-2 2/2 + + + + + + 10-3 2/2 - - - - 10-4 2/2 - - - - 10-5 2/2 - - - - 10-6 2/2 - - - - 10-7 2/2 - - - - 10-8 2/2 - - - - 100
Ghi chú: CTBđ: Canh trùng ban ựầu VK: Vi khuẩn
+: Phản ứng dương tắnh với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae -: Phản ứng âm tắnh với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae
Như vậy, có thể kết luận ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phản ứng PCR như sau: + Về ựộ ựặc hiệu của phản ứng: DNA ựược tách ra từ môi trường m- TSB có các mẫu thịt ựều cho các phản ứng PCR dương tắnh, tương ựương ựộ ựặc hiệu 100% với cả 3 loại gen VT1, VT2và eae.
+ Về ựộ nhạy của phản ứng: Với cả 3 loại thịt, ngưỡng giới hạn dưới (Lower limit) về số lượng của vi khuẩn VTEC ựể có thể phát hiện ựược trong môi trường có các mẫu thịt và ựã ựược gây nhiễm với số vi khuẩn ựạt nồng ựộ cuối cùng là 6,6 x 106 vi khuẩn/ml ựối với chủng FD523 và 6,2 x 106 vi khuẩn/ml ựối với chủng FD636. Hay nói cách khác, số lượng vi khuẩn VTEC nhiễm trong 25 g thịt tươi phải ựạt ở mức ~ 6,2 - 6,6 x 106 vi khuẩn thì mới có thể xác ựịnh ựược bằng phương pháp PCR như ựã ựược chuẩn hóa trong nghiên cứu này.
Hanna Evelina Sidjabat-Tambunan (1997) tiến hành một nghiên cứu tương tự với 2 chủng VTEC gây nhiễm trên phân lợn và cừu. DNA ựược tách chiết từ môi trường tăng sinh LB hoặc EC (ủ ở 370C qua ựêm). Kết quả cho thấy: phản ứng PCR có thể dùng ựể phát hiện với số vi khuẩn gây nhiễm vào 500 mg phân bò hoặc lợn là khoảng 10 vi khuẩn ựối với môi trường LB, hoặc