Sau khi tiến hành thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR, chúng tôi ựã xây dựng ựược một quy trình nhằm xác ựịnh sự có mặt của vi khuẩn VTEC trong các mẫu thịt.
Các bước tiến hành như sau:
- Bước 1: Cân 25 gam thịt tươi (không lấy mỡ), cắt nhỏ, cho vào túi ựựng mẫu chuyên dụng, xử l ý trong máy dập mẫu (100 lần/phút) trong 2-3 phút hoặc nghiền nhuyễn tiếp trong máy xay thịt từ 2-3 phút với vận tốc 10.000 vòng/phút.
- Bước 2: Cho mẫu ựã xử l ý vào 225 ml môi trường m-TSB. Ủ ở tủ ấm 370C trong 24 giờ.
- Bước 3: Hút 0,1 ml huyễn dịch ựã nuôi cấy, bổ sung vào 5 ml môi trường TPB (Tryptone Phophate Broth). Ủ ở tủ ấm 370C trong 6 giờ. Tiến hành tách DNA và thực hiện phản ứng PCR như ựã mô tả tại phần 2.4.2.
- Bước 4: Ria cấy trực tiếp huyễn dịch ựã nuôi cấy lên ựĩa thạch MacConkey. Ủ ở tủ ấm 370C trong 24 giờ. Chọn 3 Ờ 5 khuẩn lạc Lactose dương tắnh, tiến hành tách DNA và thực hiện phản ứng PCR như ựã mô tả tại phần 2.4.2. - Bước 5: đối với các mẫu dương tắnh, tiếp tục thực hiện phản ứng PCR với từng khuẩn lạc riêng lẻ ựể xác ựịnh các khuẩn lạc dương tắnh và xác ựịnh serotyp.
Mẫu thịt (25g, cắt nhỏ) 225 ml môi trường m-TSB 0,1 ml + 5 ml TPB Thạch MacConkey Dương tắnh Âm tắnh 3-5 khuẩn lạc Lactose (+) PCR (VT1, VT2, eae) Xác ựịnh serotyp PCR (VT1, VT2, eae) Dương tắnh Âm tắnh PCR (VT1, VT2, eae) từng khuẩn lạc 370C/6 giờ/ lắc 370C/24 giờ
3. 4. Kết quả phân lập vi khuẩn VTEC trong mẫu thịt