Phản ứng PCR ựơn mồi ựã ựược nhiều tác giả nghiên cứu và thiết lập ựể xác ựịnh sự có mặt của vi khuẩn VTEC (Helge Karch và Thomas Meyer, 1989; Oswald E. và cs, 2000). Tuy nhiên, phương pháp này ựòi hỏi một số lượng lớn phản ứng PCR ựể có thể xác ựịnh ựược các ựặc tắnh của VTEC.
Với mục ựắch tiết kiệm chi phắ, thời gian và sức lao ựộng, các phản ứng PCR ựa mồi cần thiết ựể chẩn ựoán VTEC ựã ựược nghiên cứu và áp dụng (Paton A. W. và J. C. Paton, 2002).
độc lực của VTEC gồm nhiều yếu tố khác nhau, trong ựó hai yếu tố ựộc lực chắnh là ựộc tố verocytotoxin (VT1 và VT2). Hai loại ựộc tố này gây ra một số thể bệnh ở những người bị nhiễm, từ thể bệnh tiêu chảy nhẹ ựến những thể bệnh nặng hơn như tiêu chảy có lẫn máu, viêm ruột xuất huyết, hội chứng huyết niệu, viêm màng não,...( Paton A. W. và J. C. Paton, 2002). Bên cạnh ựó, intimin cũng ựược coi là một yếu tố ựộc lực của VTEC vì là yếu tố hỗ trợ cho quá trình sản sinh ựộc tố. Intimin có bản chất là protein, mã hóa bởi gen eae, giúp cho quá trình VTEC gắn vào tế bào biểu mô ruột, gây nên
bệnh tắch bám dắnh và xâm nhập (A/E) ở niêm mạc ruột. Mối liên quan giữa việc nhiễm các chủng VTEC có khả năng sản sinh intimin và các trường hợp bệnh nặng ở người cũng ựã ựược chứng minh (Jorge Blanco và cs, 2007).
Hai loại ựộc tố VT và yếu tố intimin có liên quan mật thiết tới khả năng gây bệnh của vi khuẩn E. coli, trong ựó gen VT mã hóa cho ựộc tố VT, là nguyên nhân gây hội chứng huyết niệu trên các bệnh nhân, còn gen eae mã hóa cho yếu tố bám dắnh intimin Ờ là yếu tố then chốt giúp cho vi khuẩn tấn công qua niêm mạc ựường tiêu hóa.
Theo ựó, trong nghiên cứu này, chúng tôi ựã xây dựng một phương pháp PCR ựa mồi nhằm xác ựịnh 3 loại gen ựộc lực của các chủng VTEC ựối chứng, từ ựó áp dụng ựối với các chủng phân lập ựược, lần lượt là gen VT1 mã hóa cho ựộc tố VT1, gen VT2 mã hóa cho ựộc tố VT2 và gen eae mã hóa cho yếu tố intimin.
Thắ nghiệm ựược tiến hành với 3 chủng vi khuẩn, gồm 2 chủng ựối chứng dương (FD523, FD636) và 1 chủng ựối chứng âm (C-600). DNA mẫu là một lượng nhỏ khuẩn lạc của vi khuẩn ựã ựược nuôi cấy trên ựĩa thạch máu cừu (370C/24 giờ).
Ban ựầu, phản ứng PCR ựơn ựược thực hiện với từng cặp mồi riêng biệt, sau ựó, phản ứng PCR phức ựược thực hiện với sự phối hợp ựồng thời của 3 cặp mồi. Kết quả ựược thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR ựơn và ựa mồi ựể phát hiện một số gen ựộc lực của VTEC
PCR ựơn mồi PCR ựa mồi
Các chủng kiểm tra
VT1 VT2 eae VT1 VT2 eae
FD523 + + - + + -
FD636 + + + + + +
Kết quả cho thấy: Phản ứng PCR phức với cả 3 loại cặp mồi ựều cho các sản phẩm riêng biệt và ổn ựịnh như trong phản ứng với từng cặp mồi riêng biệt. Ngoài ra, phản ứng PCR phức còn thể hiện một số ưu ựiểm khác: tiết kiệm thời gian, công lao ựộng, và ựặc biệt là tiêu hao vật tư, hóa chất cho 1 phản ứng cũng giảm ựáng kể. Do ựó, ựể xác ựịnh vi khuẩn VTEC trong thịt nên sử dụng phản ứng PCR phức hay PCR ựa mồi.