- Cỏc phản ứng lờn men ủườ ng:
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.6. Kết quả xỏc ủị nh serotype của vi khuẩn phõn lập ủượ c
Sau khi ủó cú kết quả khẳng ủịnh chắc chắn rằng cỏc chủng vi khuẩn mà chỳng tụi phõn lập ủược là A. pleuropneumoniae và P. multocida, chỳng tụi tiến hành xỏc ủịnh serotype của chỳng.
- Với vi khuẩn A. pleuropneumoniae: chỳng tụi tiến hành ủịnh type huyết thanh học của chỳng bằng khỏng huyết thanh chuẩn của Nhật Bản và Úc.
- Với vi khuẩn P. multocida: Chỳng tụi sử dụng phản ứng Multiplex- PCR ủể xỏc ủịnh cỏc type giỏp mụ A, B, D của cỏc chủng P. multocida phõn lập ủược theo quy trỡnh ủó ủược chuẩn húa của Bộ mụn Vi trựng-Viện thỳ y (đỗ Ngọc Thỳy và cs, 2007 [15]). Giỏp mụ là yếu tố ủộc lực quan trọng của vi khuẩn P. multocida, nú ủúng vai trũ quan trọng trong quỏ trỡnh gõy bệnh của vi khuẩn này. P. multocida ủược chia làm 5 type giỏp mụ là A, B, D, E và F tựy thuộc vào cấu trỳc của Polysaccharide bề mặt. Trong ủú cỏc type gõy bệnh ở lợn ủược thụng bỏo là A, B và D.
Cỏc cặp mồi mà chỳng tụi sử dụng cho phản ứng PCR ủịnh type giỏp mụ vi khuẩn P. multocida là: CAPA-F và CAPA-R dựng ủể xỏc ủịnh type A cho kớch cỡ sản phẩm là 1044bp, CAPB-F và CAPB-R ủể xỏc ủịnh type B cho sản phẩm là 760bp, CAPD-F và CAPD-R ủể xỏc ủịnh type D cho sản phẩm là 657bp. Cỏc bước tiến hành phản ứng PCR như ủó mụ tả ở phần nguyờn liệu và phương phỏp nghiờn cứu.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 57
Bảng 4.9 Kết quả xỏc ủịnh serotype của cỏc chủng vi khuẩn
A. pleuropneumoniae và P. multocida phõn lập ủược
Vi khuẩn Số chủng thử Phương phỏp Kết quả ủịnh type Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Serovar 1 1 11,11 Serovar 2 6 66,67 A. pleuropneumoniae 9 Ngưng kết Serovar 5 2 22,22 Type A 12 85,71 P. multocida 14 PCR Type D 2 14,29 Kết quảở bảng 4.9 cho thấy:
- 9 chủng A. pleuropneumoniae phõn lập ủược ủều thuộc cỏc serovar 1, 2 và 5. Trong ủú, ủa số cỏc chủng thuộc về serovar 2, với 6/9 chủng, chiếm tỷ lệ 66,67%; Tiếp ủến là 5 chủng thuộc serovar 5, chiếm tỷ lệ 22,22%, cũn lại là 1 chủng thuộc serovar 1 (tỷ lệ 11,11%). Như vậy, cỏc chủng A.
pleuropneumoniae mà chỳng tụi phõn lập ủược phần lớn thuộc serovar 2 và 5,
nờn cú thể thấy vai trũ của chỳng rất lớn với bệnh viờm phổi của lợn, ủặc biệt là serovar 2.
Kết quả ủịnh type của chỳng tụi cũng khỏ tương ủồng với kết quả nghiờn cứu của tỏc giả Nguyễn Lờ Hoa (2001) [5], cũng xỏc ủịnh ủược 3 serovar trờn song tỷ lệ khỏc với chỳng tụi. Riờng serovar 1 chiếm ủến 10,3% cao hơn so với kết quả của chỳng tụi, serovar 2 và 5 cựng chiếm tỷ lệ cao 41,4%.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 58
[10], serovar 1, 2, 5 cũng ủược tỡm thấy ở cỏc trại lợn nước ta song theo hai nhúm tỏc giả này thỡ tỷ lệ serovar 5 cao hơn so với serovar 2, khụng giống với kết quả chỳng tụi thu ủược.
Theo Desrosiers và cs (1984) [25]; Brandreth và Smith (1985) [21]: Bệnh viờm phổi truyền nhiễm của lợn cú phõn bố rộng rói. Nú ngày càng trở nờn quan trọng do việc chăn nuụi lợn ngày một phỏt triển. Bệnh cú mặt và lan truyền ở hầu hết cỏc nước chõu Âu và một phần ở Mỹ, Canada, Mexico, Nam Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc và Úc. Mặc dự chỉ một vài serovar là thịnh hành trờn những nước nhất ủịnh, như serovar 2 ở Thụy điển, đức và Thụy Sĩ và serovar 1 và 5 ở Mỹ và Canada nhưng cũng cú thể thấy một số serovar ở cựng một nước. Một số serovar ủược coi là ớt ủộc (vớ dụ như serovar 3 cú ủộc lực rất thấp) và về dịch tễ chỳng khụng quan trọng ở một số nước nhưng lại cú thể gõy nờn dịch ở một số nước khỏc.
- Với 14 chủng P. multocida phõn lập ủược ủem ủịnh type bằng phản ứng PCR cho thấy:
+ Hầu hết cỏc chủng thuộc type A với 12/14 chủng (chiếm tỷ lệ 85,71%), cỏc chủng này ủều cho sản phẩm PCR là 1044bp (ảnh 3.8).
+ 2 chủng còn lại thuộc type D (chiếm tỷ lệ 14,29%), với sản phẩm PCR là 657bp (ảnh 8).
Qua đây có thể kết luận rằng các chủng P. multocida mà chúng tôi phân
lập đ−ợc đều thuộc các type A và D.
Đỗ Ngọc Thúy và cs (2007) [15] khi ứng dụng kỹ thuật PCR để định
type giáp mô của các chủng P. multocida phân lập đ−ợc từ vật nuôi cho biết:
hầu hết các chủng phân lập đ−ợc từ dịch ngoáy mũi của lợn khỏe, phổi hoặc dịch hầu họng của lợn tại lò mổ đều thuộc type A, trừ một chủng phân lập từ phổi lợn bị bệnh viêm phổi thuộc type D.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 59
Ảnh 4.8Kết quả của phản ứng PCR ủịnh type vi khuẩn P. multocida
- M: Thang chuẩn 1000 bp
- Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 9, 11: P. multocida type A (sản phẩm 1044bp)
- Giếng 7: đ/C dương P. multocida type A
- Giếng 10, 12, 13: P. multocida type D (sản phẩm 760 bp)
- Giếng 14: đ/C dương P. multocida type D
- Giếng 6, 8: đ/C õm
Kết quả này cũng hoàn toàn phự hợp với những nghiờn cứu ủó ủược cụng bố trước ủõy của Townsend, K. M và cs (2000) [39]. Tỏc giảủó kết luận rằng 17 chủng P. multocida phõn lập ủược từ hầu họng của lợn khỏe tại lũ mổ ở cỏc tỉnh Cần Thơ và Kiờn Giang, Việt Nam ủều thuộc về type A3, D1 hoặc D3. đồng thời cũng phự hợp với cỏc nghiờn cứu về vi khuẩn P. multocida gõy bệnh trờn lợn của De Alwis, M. C. L.(1992) [19] . Tỏc giả ủó tổng kết cỏc nghiờn cứu ở nhiều nước trờn thế giới và kết luận rằng cỏc chủng P. multocida thuộc type A thường ủược phỏt hiện thấy ở phổi hoặc ủường hụ hấp trờn của lợn khỏe mạnh mà khụng gõy bệnh hoặc gõy bệnh ở phổi, cỏc chủng thuộc type D và ủụi khi là type A cộng phỏt với một số loại vi khuẩn khỏc như
Bordetella bronchiseptica thường gõy bệnh viờm teo mũi, cũn cỏc chủng type
1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14 M 8 9 10 11 12 13 14 M 1044 bp 1044 bp 657 bp 1000bp 1000bp
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 60
B thường gõy ra thể bệnh bại huyết xuất huyết (bệnh Tụ huyết trựng).
Tuy nhiờn, khi so sỏnh với kết quả nghiờn cứu của Cự Hữu Phỳ và cs (2005) [11] thỡ kết quả thu ủược của chỳng tụi cú sự khỏc biệt. Cỏc tỏc giả ủịnh type của 48 chủng P. multocida phõn lập ủược từ 542 mẫu dịch ngoỏy mũi của lợn khỏe và kết quả là 100% cỏc chủng kiểm tra thuộc type D. Sở dĩ cú sự khỏc biệt này cú thể là do cỏc chủng P. multocida mà cỏc tỏc giả kiểm tra ủược phõn lập từ dịch ngoỏy mũi, cũn chỳng tụi phõn lập từ dịch ngoỏy họng và phổi.
Xỏc ủịnh serotyp của Streptococcus suis bằng phương phỏp PCR
Cỏc chủng Streptococcus tiếp tục thực hiện phản ứng MP- PCR ủể xỏc ủịnh serotyp, gồm cú: serotyp 1, 2, 7 và 9. đõy là những serotyp gõy bệnh chớnh của vi khuẩn S. suis. Phản ứng MP- PCR cho phộp nhận ra sự khỏc nhau của 4 serotyp cps (1, 2, 7 và 9). Cỏc cặp mồi sử dụng trong phương phỏp MP- PCR ủược lựa chọn dựa vào chuỗi gen mó húa quỏ trỡnh sinh tổng hợp thành phần polysaccharide của giỏp mụ (cps), gồm cú 4 cặp mồi sau: cps 1 J-F và cps 1 J-R (ủể xỏc ủịnh serotyp 1), cps 2 J-F và cps 2 J-R (ủể xỏc ủịnh serotyp 2), cps 7 H-F và cps 7 H-R (ủể xỏc ủịnh serotyp 7), cps 9 H- F và cps 9 H-R (ủể xỏc ủịnh serotyp 9). Cỏc cặp mồi này cho sản phẩm cú kớch cỡ tương ứng là 637 bp, 498 bp, 379 bp và 303 bp. Kết quả ủược trỡnh bày ở bảng 4.10.
Kết quảở bảng 4.10 cho thấy: Trong tổng số 37 chủng vi khuẩn S. suis ủược xỏc ủịnh ủó xỏc ủịnh ủược tổng số 7 chủng thuộc serotyp 1, 20 chủng thuộc serotyp 2, 2 chủng thuộc serotyp 7. Khụng cú chủng S. suis nào thuộc serotyp 9. Tỷ lệ cỏc chủng S. suis thuộc serotyp 1, 2, 7 và 9 cú tỷ lệ tương ứng: 18,92%, 54,05%, 5,41% và 0%.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 61
Bảng 4.10: Kết quả xỏc ủịnh serotyp của cỏc chủng vi khuẩn S. suis
Tỷ lệ cỏc chủng S. suis thuộc serotyp 2 và 7 cú tỷ lệ tương ứng: 54,05% và 5,41%, cũng ủó sử dụng 4 cặp mồi của 4 serotyp 1, 2, 7 và 9, cho sản phẩm cú kớch cỡ tương ứng là: 637 bp, 498 bp, 379 bp và 303 bp ủể xỏc ủịnh cỏc serotyp của 210 chủng S. suis phõn lập từ lợn bệnh, tỷ lệ cỏc chủng thuộc serotyp 2 cao nhất là 24,7% và cỏc chủng thuộc serotyp 7 và 9 chiếm tỷ lệ tương ứng: 8,6% và 10%. Tuy nhiờn, theo kết quả nghiờn cứu của nhúm tỏc giả này, tỷ lệ cỏc chủng thuộc serotyp 9 chiếm 10%, cũn trong nghiờn cứu này khụng cú chủng nào thuộc serotyp 9.
Kết quả kiểm tra Số mẫu Serotyp1 (637 bp) Tỷ lệ % Serotyp 2 (498 bp) Tỷ lệ % Serotyp 7 (379 bp) Tỷ lệ % Serotyp 9 (303 bp) Tỷ lệ % 37 7 18,92 20 54,05 2 5,41 0 0 1 2 3 4 5 6 7 M ảnh 9 Các sản phẩm của phản ứng PCR sau quá trình điện di để xác định serotyp của vi khuẩn S . suis. M: 100 bp marker. Giếng 1 và 7: serotyp 2. Giếng 4: serotyp 1. Giếng 5, 6: serotyp 7. Giếng 2, 3: âm tắnh.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 62