VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.1. ðối tượng nghiờn cứu
Vi khuẩn Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae,
Streptococcus gõy bệnh cho lợn ở cỏc lứa tuổi nghi mắc hội chứng rối loạn
hụ hấp và sinh sản ở cỏc tỉnh Thỏi Bỡnh, Hải Phũng, Hưng Yờn, Bắc Ninh.
3.2. Nội dung nghiờn cứu
3.2.1. Tỡnh hỡnh hội chứng rối loạn hụ hấp và sinh sản ở cỏc ủàn lợn nuụi tại cỏc tỉnh Thỏi Bỡnh, Hải Phũng, Hưng Yờn, Bắc Ninh. cỏc tỉnh Thỏi Bỡnh, Hải Phũng, Hưng Yờn, Bắc Ninh.
3.2.2. Phõn lập vi khuẩn Pasteurella multocida, Actinobacillus
pleuropneumoniae, Streptococcus suis từ bệnh phẩm lợn nghi mắc hội chứng
hụ hấp và sinh sản.
3.2.3. Xỏc ủịnh một sốủặc tớnh sinh vật hoỏ học của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập ủược. lập ủược.
3.2.4. Xỏc ủịnh ủộc lực của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập ủược.
3.2.5. Xỏc ủịnh serotyp của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập ủược.
3.3. Nguyờn liệu dựng cho nghiờn cứu
3.3.1. Mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm là phổi của những lợn ốm, chết do hội chứng rối loạn hụ hấp và sinh sản nuụi tại cỏc tỉnh Thỏi Bỡnh, Hải Phũng, Hưng Yờn, Bắc Ninh.
3.3.2 ðộng vật thớ nghiệm
- Chuột nhắt trắng trọng lượng 18-20gram - Lợn sau cai sữa 35 ngày tuổi khỏe mạnh
3.3.3 Mụi trường, húa chất
Mụi trường dựng là mụi trường do hóng Oxoid (Anh), Merck (Phỏp) sản
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 32
xuất gồm: - Mụi trường nước thịt - Mụi trường thạch trường - Mụi trường thạch mỏu
- Mụi trường thạch TSA (Tryptic Soy Agar) - Mụi trường thạch Chocolate
- Mụi trường MacConkey
- Mụi trường BHI (Brain Heart Infusion) - Mụi trường cỏc loại ủường:
- Dung dịch PBS (Phosphat Buffer Solution): - Giấy thử Oxidase.
- Thuốc thử phản ứng Catalase: Dung dịch H2O2 3% - Dung dịch Kovac’s:
- Dung dịch thuốc nhuộm gram.
3.3.4. Giống vi khuẩn - dụng cụ - mỏy múc
- Giống vi khuẩn P. multocida, A. Pleuropneumoniae, Streptococcus
chuẩn do Úc và Nhật Bản cung cấp. Sử dụng là chủng ủối chiếu với cỏc chủng vi khuẩn phõn lập ủược trong phản ứng PCR và huyết thanh học.
- Giống vi khuẩn Staphylococcus aureus dựng cấy kốm khi phõn lập vi khuẩn A. pleuropneumoniae.
- Khỏng huyết thanh chuẩn dựng ủịnh type vi khuẩn A.
pleuropneumoniae, của Úc và Nhật Bản.
- Dụng cụ mỏy múc trong phũng thớ nghiệm. 3.4. Phương phỏp nghiờn cứu
3.4.1. Phương phỏp lấy mẫu
Lấy bệnh phẩm của những lợn ở cỏc lứa tuổi nghi mắc hội chứng rối loạn hụ hấp và sinh sản ở cỏc tỉnh Thỏi Bỡnh, Hải Phũng, Hưng Yờn, Bắc Ninh.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 33
3.4.2. Phương phỏp nuụi cấy, phõn lập vi khuẩn
- ðối với bệnh phẩm là phổi, trước khi nuụi cấy lờn cỏc loại mụi trường nờu ở trờn thỡ vị trớ phổi lẫy mẫu ủược ủốt chỏy bề mặt, dựng mũi kộo cắt vào phần phổi ủó bị ủốt chỏy và lấy phần bệnh phẩm ở phớa sõu bờn trong dựng nuụi cấy ủể trỏnh tạp khuẩn.
Sau khi nuụi cấy 24 giờ, căn cứ vào ủặc ủiểm hỡnh thỏi khuẩn lạc của vi
khuẩn Actinobacillus, Pasteurella và Streptococcus, tớnh chất mọc trờn cỏc
mụi trường sẽ tiến hành chọn khuẩn lạc ủiển hỡnh, phết kớnh nhuộm Gram kiểm tra hỡnh thỏi vi khuẩn dưới kớnh hiển vi với ủộ phúng ủại 1500 lần, ủồng thời làm cỏc phản ứng sinh húa và cấy giữ giống ủể dựng cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
- Khuẩn lạc Pasteurella multocida ủược nuụi cấy trờn mụi trường thạch mỏu ở 370C trong 24 giờ cú dạng trũn trơn, màu trắng ủục, cú mựi tanh của nước dói khụ. Khụng dung huyết trờn thạch mỏu, khụng mọc trờn mụi trường MacConkey, phản ứng Indol dương tớnh, phản ứng Oxydaza, Catalaza dương tớnh, khụng di ủộng.
- Khuẩn lạc Actinobacillus pleuropneumoniae sau khi nuụi cấy trờn mụi trường thạch mỏu và thạch Chocolate ở 370C trong 24 giờ trong ủiều kiện cú 5% CO2 thấy khuẩn lạc nhỏ như giọt sương, hầu hết cỏc chủng ủều gõy dung huyết.
- ðối với vi khuẩn Streptococcus: Sau khi bồi dưỡng vi khuẩn ở 37oC trong 24 giờ, căn cứ vào ủặc ủiểm khuẩn lạc ủể chọn ra những khuẩn lạc ủiển hỡnh của vi khuẩn Streptococcus trờn mụi trường thạch mỏu, phết kớnh nhuộm Gram, kiểm tra hỡnh thỏi, làm cỏc phản ứng sinh hoỏ, cấy giữ giống ủể dựng cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
Phương phỏp nuụi cấy phõn lập vi khuẩn từ bệnh phẩm ủược tiến hành theo sơủồ sau:
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 34
Sơủồ phõn lập vi khuẩn
Mẫu phổi bệnh phẩm Nuụi cấy trờn cỏc mụi trường:
Nước thịt, thạch mỏu, thạch MacConkey, thạch Chocolate Phõn lập, thuần khiết từng loại khuẩn lạc
Nhuộm Gram kiểm tra hỡnh thỏi vi khuẩn
Giỏm ủịnh vi khuẩn qua cỏc ủặc tớnh sinh hoỏ và lờn men ủường
3.4.3. Phương phỏp thử cỏc ủặc tớnh sinh hoỏ của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập ủược phõn lập ủược