- Nghiên cứu một số các biểu hiện triệu chứng lâm sàng của lợn nghi mắc
3.5.1. Phương pháp lấy mẫu, bảo quản mẫu và làm tiêu bản
* Phương pháp lấy mẫu :
Các mẫu này ựược lấy theo quy ựịnh tiêu chuẩn của ngành:
để xác ựịnh ựược các biến ựổi ựại thể của một số cơ quan, tổ chức của lợn nghi mắc PRRS cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh. Lợn bệnh ựược cố ựịnh cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ ựể ựông rồi chắt lấy huyết thanh.
Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sát và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, hạch phổi, tim, gan, lách, thậnẦ làm hai bộ. Một bộ ngâm trong formol 10% ựể làm tiêu bản vi thể, một bộ mẫu tươi bảo quản ựông lạnh Ờ 700C ựể phân lập virus.
Yêu cầu của việc lấy mẫu: cần lấy ựúng, lấy ựủ:
+ Lấy ựúng: lấy ựúng cơ quan, ựúng vùng tổn thương ựiển hình
+ Lấy ựủ: lấy ựủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và ựủ lượng cần thiết. * Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ựổi ựại thể cần tiến hành làm tiêu bản ựể xác ựịnh bệnh tắch vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin Ờ Eosin (HE). Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Cố ựịnh bệnh phẩm
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%.
Vùi bệnh phẩm
Tiến hành lần lượt các bước sau:
- Rửa focmol: Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h. - đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng.
Bảng 3.1 Quy trình hoạt ựộng của hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng
Bình Hóa chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600C 1:00 2 Cồn 600C 1:00 3 Cồn 700C 1:30 4 Cồn 800C 1:30 5 Cồn 960C 1:30 6 Cồn 1000C 1:30 7 Cồn 1000C 1:30 8 Cồn 1000C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00
đúc tiêu bản
đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin.
Cắt dán mảnh và cố ựịnh tiêu bản
Cắt mảnh: bằng máy microtom. mỗi lát cắt từ 2-3 ộm.
Tãi mảnh: Dàn lát cắt bằng phẳng trên phiến kắnh trong nước ấm 480C. Sau ựó ựể tủ ấm 370C ựến khi bệnh phẩm khô là có thể ựem nhuộm ựược.
Nhuộm tiêu bản
Các bước tiến hành:
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:
Xylen I: 10 phút
Xylen II: 10 phút Xylen III: 10 phút
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000: 2 lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950: 1 lần Cồn 700: 1 lần Cồn 500: 1 lần
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút. + Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)
Nhỏ haematoxilin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước.
Sau ựó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:
Cồn 500: 1 lần
Cồn 700: 1 lần
Cồn 950: 1 lần
Cồn 1000: 2 lần
Rửa tiêu bản
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút, rửa nước. Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản ựi qua xylen .
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Kiểm tra tiêu bản trên kắnh hiển vi quang học.