- Nghiên cứu một số các biểu hiện triệu chứng lâm sàng của lợn nghi mắc
3.5.3. Phương pháp phân lập virus
Chuẩn bị tế bào: Nuôi cấy tế bào Marc - 145 trong khay 96 giếng.
Chuẩn bị môi trường ựầy ựủ (DMEM, 10% FBS làm ấm trong tủ ấm 37oC trong 30 phút trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy)
Bước 1: Giải ựông tế bào ở nhiệt ựộ phòng.
Bước 2: Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào. Bước 3: Chuyển tế bào vào khay nuôi cấy có chứa môi trường ựầy ựủ. Bước 4: Cho khay vào tủ ấm 370C có 5%CO2. Quan sát tế bào hàng ngày ựến khi tế bào mọc ựẹp thành một lớp thì gây nhiễm bệnh phẩm nghi có PRRSV ựã ựược chuẩn bị sẵn.
Chuẩn bị mẫu phân lập
- Mẫu bệnh phẩm nghi có PRRSV sau khi lấy ựược bảo quản trong tủ lạnh -700C.
- Khi cần phân lập, lấy 2g bệnh phẩm nghiền trong chày và cối vô trùng, bổ sung thêm 600ộl DMEM mỗi mẫu, tiến hành ly tâm 2000 vòng/phút/4 phút/40C. Huyễn dịch ựược ly tâm bỏ cặn và lấy phần nước trong.
Tiến hành
Lấy mẫu gây nhiễm vào khay 96 giếng có phủ tế bào Marc -145 một lớp (tế bào Marc -145 một lớp khi quan sát dưới kắnh hiển vi ựiện tử phải ựạt yêu cầu là tế bào phủ kắn bề mặt bình, giếng nuôi cấy và không chồng chéo lên nhau). Mỗi mẫu
gây nhiễm vào 3 giếng với các nồng ựộ khác nhau ựã ựược pha loãng theo cơ số 2. để khay nuôi cấy trong tủ ấm 37 0C có 5%CO2. Quan sát CPE tại các thời ựiểm sau 12; 24; 36; 48; 60 giờ. Bệnh phẩm ựược ựồng nhất trong môi trường DMEM có bổ sung thành phần kháng sinh ( tỷ lệ 1:10)
- Khi xuất hiện CPE (90%) thì thu virus , bảo quản trong tủ lạnh -700C hoặc trong Nitơ lỏng ựến khi cần sử dụng.
