III. VẬT LIỆU NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨ U
3.4.3. Phương phỏp nghiờn cứu trong phũng thớ nghiệ m
3.4.3.1. Cỏch ủiều chờ cỏc loại mụi trường
Mụi trường SPA
ðong 1000ml nước cất vào xoong ủó rửa sạch. Cõn agar, ủường pepton, húa chất cho lần lượt vào xoong. Khuấy ủều cho tan hết rồi ủặt lờn bếp ủun sụi. ðổ ra bỡnh tam giỏc hoặc phõn ra cỏc ống nghiệm, mỗi ống 35ml, trỏnh làm rơi rớt mụi trường vào thành ụng nghiệm. ðậy nỳt bụng ủem hấp vụ trựng ở nhiệt ủộ 1210C, 1,5 at trong 30 phỳt.
Mụi trường lỏng: cũng ủiều chế như mụi trường SPA nhưng phải cất cẩn thận vỡ ủõy là mụi trường khụng cú agar.
3.4.3.2. Cỏch phõn lập vi khuẩn
Theo Nguyễn Văn Tuất, (2002) [15].
Dựa vào triệu chứng bệnh trờn ủồng ruộng, mẫu ủược thu thập về
phũng thớ nghiệm và phõn lập theo phương phỏp của Viện BVTV ủể phõn lập và giỏm ủịnh cỏc vật gõy bệnh.
ðối với nhúm nấm gõy bệnh: sau khi phõn lập và tỏch dũng thuần, chỳng tụi tiến hành thử sức gõy bệnh của chỳng bằng cỏch thử phản ứng sinh húa siờu nhạy trờn cõy thuốc lỏ. Qua ủú xỏc ủịnh ủược cỏc isolates là ký sinh hay hoại sinh. Tiếp theo cỏc vi khuẩn ký sinh gõy phản ứng siờu nhạy trờn cõy thuốc lỏ sẽủược giỏm ủịnh bằng một số phản ứng sinh húa chuẩn và phõn tớch
kiểu triệu chứng. Một số bệnh quan trọng hại hành tỏi và khụng xuất hiện thường xuyờn thỡ sẽủược kiểm chứng tờn khoa học và triệu chứng bệnh theo chu trỡnh Kock.
Cỏc bước theo chu trỡnh Kock bao gồm: Thu mẫu bệnh ngoài tự nhiờn
Phõn lập mẫu bệnh trờn mụi trường nhõn tạo hoặc thu bào tử từ cỏc vết bệnh .
Lõy nhiễm nhõn tạo trờn cõy trồng
Chăm súc cõy trồng và quan sỏt sự hỡnh thành vết bệnh trờn cõy, khi cú triệu chứng bệnh xuất hiện, tiến hành phõn lập lại và so sỏnh với triệu chứng và mụ tản nấm hoặc vi khuẩn cú giống với triệu chứng bệnh ban ủầu ủể khẳng
ủịnh vật gõy bệnh là ủỳng.
3.4.3.3. Thử phản ứng sinh lý sinh húa cho vi khuẩn gõy bệnh
a. Thử phản ửng khử oxydase
Phương phỏp 1:
ðỏy hộp peptri lút giấy lọc Watsman nhỏ vài giọt chỉ thị ðimetyl paraphenyl enediamino dichlonide vào giữa mảnh giấy lọc lấy que cấy cấy một vũng vi khuẩn di nhẹ trong giọt chỉ thị nếu phản ứng “+” cú phản ứng oxydase thỡ màu tớm xuất hiện nhanh sau 10 – 30 giõy.
Phương phỏp khỏc: Dựng mụi trường Hugh và Leifson Bactotry peptone (cú thể dựng pepton ) 2g
NaCl 5g K2HPO4 0,3g Bromthymelblue 0,03g Glucorose 10g Nước cất 1000ml pH 6,9 -7,2
Cấy một vũng vi khuẩn cấy vào ống nghiệm mụt trường 5ml ủể tủ ủịnh ụn 250C sau 3 giõy mụi trường cú màu xanh lam ban ủầu chuyển sang màu màu vàng là phản ứng “+”.
b. Phản ứng phõn giải cỏc loại ủường (hoặc axit hữu cơ) thành axit hoặc khớ Phản ứng: Mụi trường Dowson
NH4H2 PO4 1g KOH (KCl) 0,2g MgSO4 0,2g Nước cất 1000ml (1% ủường glucorose hoặc lactose) ủường từng loại 10g
Chất chỉ thị Brom methylbleu 1 – 3ml ủược pha như sau: Brom methylbleu: 1,5g
Cồn etylic 950: 1000ml
Cấy 1 vũng vi khuẩn vào ống nghiệm mụi trường lỏng Dowson (7 ngày) nếu cú phản ứng “+” thỡ màu lục chuyển sang màu vàng chứng tỏ cú phản ứng oxy húa ủường thành axit.
Ghi chỳ: cú thể dựng chất chỉ thị metyl ủỏ thay cho Bromomethyl blue nghĩa là cho 1 – 3 ml dung dịch metyl ủỏ 0,1g pha trong 300 ml cồn etylic 950 + 500 ml nước cất nhưng ở ủõy thỡ mụi trường chuyển sang màu nếu phản
ứng (+) thỡ chuyển sang màu ủỏ (cú axit).
c. Phõn giải gelatin
Cấy chỡm sõu vi khuẩn vào trong mụi trường
Gelatin 120g
Pepton 5g
Nước cất 1000ml
Nếu cột gelatin bị nhóo dần hỡnh phễu là phản ứng (+)
d. Phõn giải tinh bột
Mụi trường tinh bột hũa tan : 5g
Cấy vi khuẩn trang phảng trờn mặt mụi trường(trong hộp peptri) sau 5 - 15 ngày thử bằng dung dịch KI ủổ lắng ủều trờn mụi trường nếu chung quanh khuẩn lạc cú màu tớm là phản ứng (-) nếu khụng cú hoặc chỉ hồng nhạt là phản ứng (+).
e. Esculin (Glucose dạng C_gluxit ủường). Mụi trường: Bacto pepton 10g Esculin 1g Citratdeferic amonical 0,7 -1g Agar 15g Nước cất 1000ml pH 7
Cấy một vũng vi khuẩn trờn mụi trường sau 24 giờ ở 250C màu mụi trường chuyển màu ủen (theo Gardan và Luisetti, 1981).
f. Thử phản ứng trờn lỏt cắt củ khoai tõy
Dựng hộp peptri ủó ủược khủ trựng cú lút giấy lọc Watsman. Khoai tõy ủược rửa sạch ủem hơi núng dưới ngọn lửa ủốn cồn dựng giao ủó ủược khử trựng cắt lỏt khoai tõy ủặt vào ủĩa peptri sau ủú dựng que cấy cấy một vũng vi khuẩn lờn trờn bề mặt lỏt cắt củ khoai tõy. Sau ủú cất trong tủủịnh ụn giữở ngưỡng nhiệt ủộ là 250C và quan sỏt sau 24, 48, 72h.
Pepton 5g
Nước cất 1000ml
i. Khảo sỏt hiệu lực của một số thuốc húa học trong phũng chống vi khuẩn Erwinia carotova trờn mụi trường SPA
Pha loóng dịch vi khuẩn tới nồng ủộ 10-8. Nhỏ vào mỗi ủĩa peptri 1ml dịch vi khuẩn trờn mụi trường SPA ủó ủể nguội ủến 40 -500C cho thuốc vào lắc ủều cho vi khuẩn hũa tan trong mụi trường cú thuốc chỉ tiờu theo dừi, thời gian xuất hiện khuẩn lạc và số khuẩn lạc tạo thành theo dừi ở nhiệt ủộ phũng.
3.4.4. Phương phỏp nghiờn cứu phũng trừ bệnh gõy thối nhũn hành tỏi ngoài ủồng ruộng
Phũng trừ bằng biện phỏp húa học
Thớ nghiệm ủược bố trớ theo khối ngẫu nhiờn hoàn chỉnh, 5 cụng thức 3 lần nhắc lại.
Mỗi lần nhắc 15m2, ðiều tra ủịnh kỳ 7 ngày 1 lần
CT1: Dựng thuốc Bellat C 2% phun vào ủất trước khi trồng liều lượng gấp 2 lần so khuyến cỏo và phun vào cõy khi chớm bệnh theo khuyến cỏo.
CT2: Dựng thuốc Newkasuran16.6 BTN 2% nhỳng vào tộp hành, tỏi trước khi trồng
CT3: Dựng thuốc Boodo 2% phun khi bệnh mới xuất hiện nhắc lại sau 7 ngày.
CT4: Dựng phõn vi sinh vật bún gốc trước trồng TM1 20kg/ sào – Viện Bảo vệ Thực vật.
CT5: ðối chứng Khụng phun thuốc.
Ngoài ra cũn ỏp dụng cỏc biện phỏp cơ giới vật lý nhằm hạn chế sự
phỏt sinh phỏt triển của bệnh thối nhũn trờn hành tỏi.