III. VẬT LIỆU NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨ U
3.4. Phương phỏp nghiờn cứu
3.4.1. Phương phỏp ủiều tra thu mẫu ngoài ủồng ruộng
3.4.1.1 ðiều tra diễn biến bệnh hại
- ðiều tra diễn biến bệnh hại hành tỏi trờn ủồng ruộng huyện Kinh Mụn, Kim Thành tỉnh Hải Dương theo 5 ủiểm chộo gúc mỗi ủiểm chon 2 m2
ủiều tra ủịnh kỳ 7 ngày 1lần.
- ðiều tra thành phần và mức ủộ gõy hại của cỏc bệnh chớnh hại hành tỏi tại Kinh Mụn và Kim Thành.
- ðiều tra ảnh hưởng của cỏc chõn ủất khỏc nhau ủến sự phỏt sinh phỏt triển của bệnh thối nhũn hại hành tỏi.
- ðiều tra ảnh hưởng của cỏc chế ủộ phõn bún khỏc nhau ủến sự phỏt sinh phỏt triển của bệnh thối nhũn hại hành tỏi.
- ðiều tra sự ảnh hưởng cỏc thời vụ (vụ sớm, chớnh vụ, vụ muộn) ủến sự phỏt sinh gõy hại của bệnh.
Chỉ tiờu theo dừi:
Tổng số (củ) bị bệnh
- Tỷ lệ bệnh (%) : = x 100
Tổng số (củ) ủiều tra
3.4.2. Phương phỏp nghiờn cứu ngoài nhà lưới
3.4.2.1. Phương phỏp lõy bệnh nhõn tạo
a. Phương phỏp cắm tăm
Dựng tăm nhọn dầu ủó khử trựng quệt vào vi khuẩn trờn bề mặt ống nghiệm 48 - 72 giờ. Chõm một số nỳt vào quả (cà chua), khụng rỳt tăm. Quan sỏt thớ nghiệm [15].
b. phương phỏp sỏt thương rễ
Lấy vi khuẩn thuần hũa vào nước nồng ủộ vừa ủủ. Gõy sthương rễ cõy sau ủú tưới trực tiếp dịch vi khuẩn vào rễ cõy [15].
c. Phương phỏp tưới dịch vi khuẩn
Lấy vi khuẩn thuần hũa vào nước với nồng ủộ vừa ủủ. Tưới vào những cõy hành tỏi sau khi trồng 35 – 40 ngày tuổi. ðể kiểm tra mức ủộ phỏt sinh phỏt triển của bệnh và thời gian tiềm dục của bệnh [15].
d. Phương phỏp thử phản ứng siờu nhạy trờn cõy thuốc lỏ
Thớ nghiệm ủược tiến hành trờn thuốc lỏ với cỏc dũng vi khuẩn ủược phõn lập từ cõyhành và cõy tỏi.
Tiờm dịch vi khuẩn Erwinia.carotovora với liều lượng 0,1ml/lỏ thuốc lỏ. Thử phản ứng siờu nhạy trờn mụ thuốc lỏ bằng cỏch tiờm dịch khuẩn vào mụ khỏe, kiểm tra mụ lõy nhiễm sau 24, 36 và 48 giờ. Nếu mụ thuốc lỏ cú hiện tượng bị mất màu diệp lục, dần ngả vàng và sau ủú mụ lỏ bị khụ so với
ủối chứng tiờm nước ló (lỏ xanh bỡnh thường) [15].
3.4.3. Phương phỏp nghiờn cứu trong phũng thớ nghiệm
3.4.3.1. Cỏch ủiều chờ cỏc loại mụi trường
Mụi trường SPA
ðong 1000ml nước cất vào xoong ủó rửa sạch. Cõn agar, ủường pepton, húa chất cho lần lượt vào xoong. Khuấy ủều cho tan hết rồi ủặt lờn bếp ủun sụi. ðổ ra bỡnh tam giỏc hoặc phõn ra cỏc ống nghiệm, mỗi ống 35ml, trỏnh làm rơi rớt mụi trường vào thành ụng nghiệm. ðậy nỳt bụng ủem hấp vụ trựng ở nhiệt ủộ 1210C, 1,5 at trong 30 phỳt.
Mụi trường lỏng: cũng ủiều chế như mụi trường SPA nhưng phải cất cẩn thận vỡ ủõy là mụi trường khụng cú agar.
3.4.3.2. Cỏch phõn lập vi khuẩn
Theo Nguyễn Văn Tuất, (2002) [15].
Dựa vào triệu chứng bệnh trờn ủồng ruộng, mẫu ủược thu thập về
phũng thớ nghiệm và phõn lập theo phương phỏp của Viện BVTV ủể phõn lập và giỏm ủịnh cỏc vật gõy bệnh.
ðối với nhúm nấm gõy bệnh: sau khi phõn lập và tỏch dũng thuần, chỳng tụi tiến hành thử sức gõy bệnh của chỳng bằng cỏch thử phản ứng sinh húa siờu nhạy trờn cõy thuốc lỏ. Qua ủú xỏc ủịnh ủược cỏc isolates là ký sinh hay hoại sinh. Tiếp theo cỏc vi khuẩn ký sinh gõy phản ứng siờu nhạy trờn cõy thuốc lỏ sẽủược giỏm ủịnh bằng một số phản ứng sinh húa chuẩn và phõn tớch
kiểu triệu chứng. Một số bệnh quan trọng hại hành tỏi và khụng xuất hiện thường xuyờn thỡ sẽủược kiểm chứng tờn khoa học và triệu chứng bệnh theo chu trỡnh Kock.
Cỏc bước theo chu trỡnh Kock bao gồm: Thu mẫu bệnh ngoài tự nhiờn
Phõn lập mẫu bệnh trờn mụi trường nhõn tạo hoặc thu bào tử từ cỏc vết bệnh .
Lõy nhiễm nhõn tạo trờn cõy trồng
Chăm súc cõy trồng và quan sỏt sự hỡnh thành vết bệnh trờn cõy, khi cú triệu chứng bệnh xuất hiện, tiến hành phõn lập lại và so sỏnh với triệu chứng và mụ tản nấm hoặc vi khuẩn cú giống với triệu chứng bệnh ban ủầu ủể khẳng
ủịnh vật gõy bệnh là ủỳng.
3.4.3.3. Thử phản ứng sinh lý sinh húa cho vi khuẩn gõy bệnh
a. Thử phản ửng khử oxydase
Phương phỏp 1:
ðỏy hộp peptri lút giấy lọc Watsman nhỏ vài giọt chỉ thị ðimetyl paraphenyl enediamino dichlonide vào giữa mảnh giấy lọc lấy que cấy cấy một vũng vi khuẩn di nhẹ trong giọt chỉ thị nếu phản ứng “+” cú phản ứng oxydase thỡ màu tớm xuất hiện nhanh sau 10 – 30 giõy.
Phương phỏp khỏc: Dựng mụi trường Hugh và Leifson Bactotry peptone (cú thể dựng pepton ) 2g
NaCl 5g K2HPO4 0,3g Bromthymelblue 0,03g Glucorose 10g Nước cất 1000ml pH 6,9 -7,2
Cấy một vũng vi khuẩn cấy vào ống nghiệm mụt trường 5ml ủể tủ ủịnh ụn 250C sau 3 giõy mụi trường cú màu xanh lam ban ủầu chuyển sang màu màu vàng là phản ứng “+”.
b. Phản ứng phõn giải cỏc loại ủường (hoặc axit hữu cơ) thành axit hoặc khớ Phản ứng: Mụi trường Dowson
NH4H2 PO4 1g KOH (KCl) 0,2g MgSO4 0,2g Nước cất 1000ml (1% ủường glucorose hoặc lactose) ủường từng loại 10g
Chất chỉ thị Brom methylbleu 1 – 3ml ủược pha như sau: Brom methylbleu: 1,5g
Cồn etylic 950: 1000ml
Cấy 1 vũng vi khuẩn vào ống nghiệm mụi trường lỏng Dowson (7 ngày) nếu cú phản ứng “+” thỡ màu lục chuyển sang màu vàng chứng tỏ cú phản ứng oxy húa ủường thành axit.
Ghi chỳ: cú thể dựng chất chỉ thị metyl ủỏ thay cho Bromomethyl blue nghĩa là cho 1 – 3 ml dung dịch metyl ủỏ 0,1g pha trong 300 ml cồn etylic 950 + 500 ml nước cất nhưng ở ủõy thỡ mụi trường chuyển sang màu nếu phản
ứng (+) thỡ chuyển sang màu ủỏ (cú axit).
c. Phõn giải gelatin
Cấy chỡm sõu vi khuẩn vào trong mụi trường
Gelatin 120g
Pepton 5g
Nước cất 1000ml
Nếu cột gelatin bị nhóo dần hỡnh phễu là phản ứng (+)
d. Phõn giải tinh bột
Mụi trường tinh bột hũa tan : 5g
Cấy vi khuẩn trang phảng trờn mặt mụi trường(trong hộp peptri) sau 5 - 15 ngày thử bằng dung dịch KI ủổ lắng ủều trờn mụi trường nếu chung quanh khuẩn lạc cú màu tớm là phản ứng (-) nếu khụng cú hoặc chỉ hồng nhạt là phản ứng (+).
e. Esculin (Glucose dạng C_gluxit ủường). Mụi trường: Bacto pepton 10g Esculin 1g Citratdeferic amonical 0,7 -1g Agar 15g Nước cất 1000ml pH 7
Cấy một vũng vi khuẩn trờn mụi trường sau 24 giờ ở 250C màu mụi trường chuyển màu ủen (theo Gardan và Luisetti, 1981).
f. Thử phản ứng trờn lỏt cắt củ khoai tõy
Dựng hộp peptri ủó ủược khủ trựng cú lút giấy lọc Watsman. Khoai tõy ủược rửa sạch ủem hơi núng dưới ngọn lửa ủốn cồn dựng giao ủó ủược khử trựng cắt lỏt khoai tõy ủặt vào ủĩa peptri sau ủú dựng que cấy cấy một vũng vi khuẩn lờn trờn bề mặt lỏt cắt củ khoai tõy. Sau ủú cất trong tủủịnh ụn giữở ngưỡng nhiệt ủộ là 250C và quan sỏt sau 24, 48, 72h.
Pepton 5g
Nước cất 1000ml
i. Khảo sỏt hiệu lực của một số thuốc húa học trong phũng chống vi khuẩn Erwinia carotova trờn mụi trường SPA
Pha loóng dịch vi khuẩn tới nồng ủộ 10-8. Nhỏ vào mỗi ủĩa peptri 1ml dịch vi khuẩn trờn mụi trường SPA ủó ủể nguội ủến 40 -500C cho thuốc vào lắc ủều cho vi khuẩn hũa tan trong mụi trường cú thuốc chỉ tiờu theo dừi, thời gian xuất hiện khuẩn lạc và số khuẩn lạc tạo thành theo dừi ở nhiệt ủộ phũng.
3.4.4. Phương phỏp nghiờn cứu phũng trừ bệnh gõy thối nhũn hành tỏi ngoài ủồng ruộng
Phũng trừ bằng biện phỏp húa học
Thớ nghiệm ủược bố trớ theo khối ngẫu nhiờn hoàn chỉnh, 5 cụng thức 3 lần nhắc lại.
Mỗi lần nhắc 15m2, ðiều tra ủịnh kỳ 7 ngày 1 lần
CT1: Dựng thuốc Bellat C 2% phun vào ủất trước khi trồng liều lượng gấp 2 lần so khuyến cỏo và phun vào cõy khi chớm bệnh theo khuyến cỏo.
CT2: Dựng thuốc Newkasuran16.6 BTN 2% nhỳng vào tộp hành, tỏi trước khi trồng
CT3: Dựng thuốc Boodo 2% phun khi bệnh mới xuất hiện nhắc lại sau 7 ngày.
CT4: Dựng phõn vi sinh vật bún gốc trước trồng TM1 20kg/ sào – Viện Bảo vệ Thực vật.
CT5: ðối chứng Khụng phun thuốc.
Ngoài ra cũn ỏp dụng cỏc biện phỏp cơ giới vật lý nhằm hạn chế sự
phỏt sinh phỏt triển của bệnh thối nhũn trờn hành tỏi.
3.5. Chỉ tiờu theo dừi
Tổng số (củ) bị bệnh
- Tỷ lệ bệnh (%) : = x 100
- Tớnh hiệu lực thuốc ngoài ủồng ruộng: theo cụng thức Hendersen – Title ðHH (%) = 1 x100 TbxCa TaxCb − Trong ủú:
Ta: Mức ủộ gõy hại ở cụng thức xử lý thuốc sau khi phun(thớ nghiệm) Tb:Mức ủộ gõy hại ở cụng thức xử lý thuốc trước khi phun (thớ nghiệm)
Ca: Mức ủộ gõy hại ở cụng thức ủối chứng sau thớ nghiệm Cb: Mức ủộ gõy hại ở cụng thức ủối chứng trước thớ nghiệm. - Tớnh hiệu lực thuốc trong phũng thớ nghiệm: Cụng thức Abbott ðHH (%) = − ì100 C T C Trong ủú: C: Tỷ lệ (%) cõy bị bệnh ở cụng thức ủối chứng T: Tỷ lệ (%) cõy bị bệnh ở cụng thức phun thuốc
3.6. Phương phỏp xử lý số liệu
ðược xử lý thống kờ theo cỏc chương trỡnh sẵn cú EXCEL, phần mềm IRRITSTAT 4.0.
IV. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quảủiều tra thành phần bệnh hại ngoài ủồng ruộng
Trong vụ ủụng xuõn năm 2009 – 2010 chỳng tụi tiến hành ủiều tra thành phần bệnh hại cõy hành, tỏi tại huyện Kinh Mụn và Kim Thành tỉnh Hải Dương. Bảng 4.1. Thành phần bệnh nấm và vi khuẩn hại hành tỏi ngoài ủồng ruộng vụủụng xuõn năm 2009 – 2010 Mức ủộ gõy hại STT Tờn bệnh Tờn khoa học Bộ - họ Hành Tỏi
1 Thối nhũn Ewinia carotova. Jones Bacteriaceae ++ +
2 Hộo Fusarium Fusarium.sp Tuberculariales ++ + 3 Khụ ủầu lỏ Stemphylliumbotryosum.W Pleosporales +++ +++ 4 Sương mai Peronospora destructor.U Peronosporales ++ ++ 5 Bệnh thối
hạch
Sclerotium cepivorum. Myceliales + +
Ghi chỳ: +: Tỷ lệ bệnh (0 – 5%)
++: Tỷ lệ bệnh (>5- 10%)
+++: Tỷ lệ bệnh (>10-15%)
Thành phần bệnh hại hành tỏi vụủụng xuõn năm 2009 – 2010 ngoài
ủồng ruộng gồm 5 bệnh gõy hại trong ủú cú 4 bệnh do nấm (Fusarium.ssp,
Stemphyllium botryosum.W, Peronospora destructor. U, Sclerotium cepivorum) và 1
Trong ủú bệnh gõy thối nhũn hành, tỏi do vi khuẩn Erwinia carotovora
xuất hiện từ khi hành, tỏi bắt ủầu ủẻ nhỏnh và gõy hại nặng nhất giai ủoạn hỡnh thành củ kộo dài cho tới trước thu hoạch. Và là một bệnh làm ảnh hưởng rất lớn
ủến năng suất của cõy hành và cõy tỏi.
Triệu chứng bệnh trờn ủồng ruộng là củ bị thối, búc vỏ ngoài thấy củ hoàn toàn bị thõm, sũng nước, ngủi thấy cú mựi thum thủm, búp nhẹ thấy cú dịch màu trắng nhầy nhầy. Lỏ vàng hộo ỳa, cõy chết ẻo. Bệnh gõy hại trờn cỏc giống hành ta, tỏi ta trồng tại cỏc huyện Kinh Mụn, Kim Thành tỉnh Hải Dương. Mức ủộ gõy hại của bệnh trờn cõy hành nặng hơn so với cõy tỏi.
Bệnh hại hành tỏi do nấm gồm cỏc bệnh hộo vàng do nấm Fusarium.sp,
bệnh khụ ủầu lỏ Stemphyllium botryosum.W, bệnh sương mai Peronospora destructor. U và bệnh thối hạch Sclerotium cepivorum gõy hại trờn cả hành và tỏi nhưng mức ủộ gõy hại khỏc nhau.
Bệnh hộo vàng nấm Fusarium.sp
Bệnh xuất hiện và gõy hại trờn tất cả cỏc chõn ruộng trồng hành tỏi tại huyện Kinh Mụn và Kim Thành Tỉnh Hải Dương. Bệnh gõy hại khi hành tỏi bắt ủầu hỡnh thành củ.Khi quan sỏt phần gốc cõy sỏt mặt ủất vào ủiều kiện khớ hậu cú sương mự và mưa phựn hay chõn ủất ẩm thấy cú lớp nấm màu trắng bao bọc quanh phần gốc. Hành, tỏi bắt ủầu bị hộo một cỏch từ từ ban ủầu là cỏc lỏ non, lỏ bỏnh tẻ sau ủú ủến cỏc lỏ già. Mức ủộ gõy hại của bệnh trờn cõy hành cao hơn trờn cõy tỏi.
Bệnh khụ ủầu lỏ do nấm Stemphyllium botrysum.W
Bệnh khụ ủầu lỏ xuất hiện và gõy hại nặng cho vựng trồng hành, tỏi tại huyện Kinh Mụn và Kim Thành tỉnh Hải Dương. Bệnh xuất hiện khi hành, tỏi bắt
ủầu xuống củ từ trung tuần thỏng 11 và kộo dài cho tới trước thu hoạch.
Bệnh chỉ gõy hại trờn lỏ hành và lỏ tỏi ở phần giữa của lỏ bỏnh tẻ, nấm xõm nhập và lan rộng kộo theo thõn lỏ tạo thành vết bầu dục ủầu cú màu xỏm trắng, sau 5 – 7 ngày góy gục ở giữa và khụ lụi. Chiều dài của vết bệnh cú thể kộo dài từ 10 – 20 cm. Trời ẩm và mưa phựn bệnh phỏt triển gõy hại mạnh và phớa trờn bề mặt vết bệnh cú lớp nấm màu nõu ủen. Mức ủộ gõy hại của bệnh ủối với cõy hành cao hơn so với cõy tỏi
Hỡnh 3. Triệu chứng trờn hành ta Hỡnh 4. Triệu chứng trờn tỏi ta
Bệnh sương mai Peronospora destructor. U.
Bệnh xuất hiện từ khi hành, tỏi bắt ủầu phõn phõn nhỏnh cho tới khi thu hoạch. Bệnh nặng nhất khi thời tiết cú sương muối, ủộẩm khụng khớ cao.
Vết bệnh xuất hiện trờn lỏ cú thể kộo dài thành cỏc vết ủốm lớn dài gần 4cm thỉnh thoảng vết bệnh tỏi nhợt, hoặc chuyển từ màu vàng nhạt tới màu nõu xỏm. Khi vết bệnh phỏt triển màu nõu tớm cú thể tồn tại trờn bề mặt lỏ hay di chuyển tới thõn củ trong suốt thời kỳ phỏt triển ủặc biệt là lỳc sỏng sớm. Vết ủốm bị thương tổn nặng cú thể cú màu tớm hoặc màu tớa và khụng rừ ràng khi vết bệnh bị tổn thương ban ủầu. Màu sắc của lỏ bị nhiễm dần di chuyển sang màu xanh tớa
tới vàng và vết bệnh bắt ủầu từ vết gấp ủỉnh lỏ và bao trựm cõy sụp xuống. Mức
ủộ gõy hại của bệnh trờn hành và tỏi là như nhau.
Hỡnh 5. Triệu chứng bệnh sương mai hành
Bệnh thối hạch Sclerotium cepivorum
Bệnh phỏt triển nặng khi ủất ẩm ướt và lạnh, bệnh phỏt triển chậm khi nhiệt ủộ trờn 31oC.
Triệu chứng bệnh trờn lỏ bao gồm màu vàng, ủốm ủen, và bắt ủầu hộo. Lỏ già
ảnh hưởng trước tiếp theo cõy cằn cỗi và chết toàn bộ bộ lỏ. Rễ cũng bị thối, cõy cú thể bịủột ngột chết một vựng rộng trờn cỏnh ủồng nếu ủất cú thành phần cơ giới nặng. Mức ủộ gõy hại của bệnh ủối với hành và tỏi trờn ủồng ruộng là như nhau.
4.2. Kết quảủiều tra mức ủộ gõy bệnh thối nhũn hành tỏi trờn ủồng ruộng
Trong vụủụng xuõn năm 2009 – 2010, chỳng tụi tiến hành ủiều tra bệnh thối nhũn hại hành tỏi tại huyện Kinh Mụn, Kim Thành tỉnh Hải Dương. Bệnh thối nhũn hành tỏi ủó ủược phỏt hiện ở hầu hết cỏc chõn ruộng trồng hành tỏi trong vựng.
Tại huyện Kinh Mụn và huyện Kim Thành hành tỏi ủược trồng phổ biến trong vụ ủụng xuõn từ thỏng 9 ủến thỏng 2 năm sau trờn cỏc giống chủ yếu là: Hành ta (giống hành trắng, hành tớa) và tỏi ta (giống tỏi trắng, tỏi tớa).
Qua kết quả ủiều tra trong vụ ủụng xuõn. Chỳng tụi tiến hành ủiểu tra chủ yếu trong cỏc thời kỳ cõy con, hỡnh thành củ, trước thu. Kết qủa ủiều tra