* Xột nghiệm ủịnh tớnh: làm phản ứng HA (Haemagglutination test)
Nguyờn lý: Virut Newcastle cú ủặc tớnh gõy ngưng kết hồng cầu gà do protein HN trờn bề mặt của virut cú khả năng gắn với thụ thể cú trờn bề mặt tế
bào hồng cầu làm hồng cầu bị gắn kết lại nằm dải thành hỡnh mạng nhện dưới
ủỏy ống nghiệm, sau ủú men Neuraminidaza cắt ủứt thụ thể hồng cầu làm hồng cầu lắng xuống ủỏy thành cục trũn. Vỡ vậy trong giai ủoạn ủầu của phản
ứng mới cho kết quả chớnh xỏc. Cỏch tiến hành gồm cỏc bước, theo sơủồ sau:
Ống nghiệm đC Thành phần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nước S. lý 0,9 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Virut Newcastle Hiệu giỏ 0,1 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 HC gà 1% 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Ghi chỳ: đC: đối chứng; HC : Hồng cầu
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 41
- Pha loóng virut (pha loóng bằng nước muối sinh lý vụ trựng) theo cỏc bậc pha loóng 1/2, 1/4 , 1/8, 1/16Ầ.
- Nhỏ 0,5ml hồng cầu gà 1 % vào tất cả cỏc ống virut ủó pha loóng. - Ống ủối chứng õm: nhỏ 0,5 ml nước sinh lý, sau ủú nhỏ 0,5 ml hồng cầu gà 1 %. Trộn ủều trong 1phỳt và ủọc kết quả sau 20 phỳt, khi ở ống ủối chứng õm hồng cầu lắng xuống ủỏy thành cục trũn ủỏ.
Phản ứng dương tớnh: Hồng cầu bị ngưng kết thành quầng ủỏ rạn nứt ở
dưới ủỏy lỗ (hiệu giỏ ngưng kết ủọc ởống cuối cựng trước ống khụng ngưng kết). Phản ứng õm tớnh : hồng cầu khụng bị ngưng kết mà bị lắng xuống ủỏy thành cục trũn ủỏ.
Một ủơn vị HA: là ở ủộ pha loóng virut lớn nhất mà tại ủú vẫn xảy ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu. đõy chớnh là hiệu giỏ ngưng kết.
* Dựng phản ứng HI (Haemagglutination Inhibition test) ủể xỏc ủịnh hàm lượng khỏng thể Newcastle của ủà ủiểu.
Phản ứng HI dựa trờn nguyờn lý: sau khi ủà ủiểu ủược tiờm phũng vacxin một thời gian, cú thể lấy mỏu chắt huyết thanh ủể xỏc ủịnh hàm lượng khỏng thể chống bệnh Newcastle trong mỏu ủà ủiểu ở từng thời ủiểm khỏc nhau bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà. Thụng qua hiệu giỏ của phản ứng giỳp cỏn bộ thỳ y quyết ủịnh tiờm vacxin bổ xung hay khụng tiờm
Trong phản ứng HI người ta dựng 4 ủơn vị ngưng kết ủể tiến hành phản
ứng. Phản ứng HI dựa trờn hiện tượng ức chế ngưng kột hồng cầu của virut Newcastle, bằng khỏng thểủặc hiệu. Khỏng thể trung hũa virut làm cho virut mất khả năng gõy ngưng kết hồng cầu gà. Trước khi làm phản ứng HI phải làm phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (phản ứng HA), ủể xỏc ủịnh 4 ủơn vị
ngưng kết dựng trong phản ứng HI.
Trong phản ứng HI người ta dựng 4 ủơn vị ngưng kết ủể tiến hành phản
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 42
kiểm tra xem khỏng nguyờn ủó pha ủỳng chưa bằng cỏch: Trờn tấm nhựa Microtest plates dựng 4 dóy, mỗi dóy 4 ụ, nhỏ vào mỗi ụ 0,5 ml nước muối sinh lý, sau ủú dựng khỏng nhuyờn ủó pha loóng ở 4 ủơn vị HA nhỏ vào 4 ụ
ủầu của dóy mỗi ụ 0,5 ml khỏng nguyờn, trộn ủều rồi hỳt 0,5 ml từ ụ thứ nhất sang ụ thứ 2, trộn ủều rồi hỳt 0,5 ml từ ụ thứ 2 sang ụ thứ 3, trộn ủều rồi hỳt bỏ 0,5 ml. Ta cú thư tự hiệu giỏ cỏc ụ sẽ là: ụ thứ nhỏt cú 2 ủơn vị HA, ụ thứ 2 cú 1 ủợn vị HA, ụ thứ 3 cú 0,5 ủơn vị HA. Sau ủú ta nhỏ 0,5 ml huyễn dịch hồng cầu gà 1% vào tất cả cỏc ụ, ụ thứ 4 làm ủối chứng chỉ cú nước sinh lý (0,5 ml) và hồng cầu gà (0,5 ml). Lắc nhẹ tấm nhưa ủể 20 phỳt sau ủú ủọc kết quả. Nếu hiện tượng ngưng kết xảy ra ủến ụ thứ 2 thỡ khỏng nguyờn ủó pha ủỳng. Phản ứng gồm cỏc bước, theo sơ ủồ: đối chứng ễ giếng số (+) (-) Nguyờn liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Nước SL (àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 HT ủà ủiểu (àl) Hiệu giỏ 25 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Vacxin Newcastle 4 HA (àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 HC gà 1 % (àl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Ghi chỳ: SL: sinh lý HT : Huyết thanh; HC: Hồng cầu
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 43
- Pha loóng huyết thanh ở cỏc ủộ pha loóng 1/2 , 1/4 , 1/8 , 1/16... bằng cỏch cho 25 àl nước sinh lý vào mỗi ụ, nhỏ vào ụ thứ nhất 25 àl huyết thanh ủà ủiểu, trộn ủều rồi hỳt lấy 25 àl chuyển sang ụ thứ 2. Tiếp tục trộn
ủều rồi lại hỳt 25 àl chuyển sang ụ thứ 3, cứ tiếp tục làm như vậy ủến ụ thứ
12 thỡ hỳt bỏủi 25 àl.
- Cho vào mỗi ụ phản ứng 25 àl khỏng nguyờn virut Newcastle cú chứa 4 ủơn vị HA.
- Lắc nhẹ, ủể khay phản ứng ở nhiệt ủộ phũng trong 30 phỳt cho khỏng nguyờn và khỏng thể (nếu cú) kết hợp với nhau.
- Cuối cựng cho vào tất cỏc ụ, mỗi ụ 50 àl dung dịch hồng cầu gà 1%. - Làm ụ ủối chứng:
+ đối chứng õm : cho 25 àl nước sinh lý, 25 àl dung dịch virut Newcastle (4HA) và 50 àl huyễn dịch hồng cầu gà 1%.
+ đối chứng dương: cho 50 àl nước sinh lý và 50 àl hồng cầu gà 1%. Lắc nhẹ ủể ở nhiệt ủộ phũng và ủọc kết quả sau 20 phỳt. Khi lỗ ủối chứng dương, hồng cầu lắng xuống ủỏy thành cục trũn thỡ ủọc kết quả .
Phản ứng dương tớnh: hồng cầu lắng xuống ủỏy lỗ thành cục trũn. Phản ứng õm tớnh: hồng cầu bị ngưng kết nằm dải ủều ởủỏy lỗ
Hiệu giỏ phản ứng HI ủược tớnh ở ủộ pha loóng huyết thanh cao nhất mà ở ủú vẫn cũn cú khả năng ức chế sự ngưng kết hồng cầu.
3.4.4. Phương phỏp xỏc ủịnh ngưỡng khỏng thểủể bảo hộ cho ủà ủiểu với bệnh Newcastle
Dựng phương phỏp cụng cường ủộc. Tiến hành tại Trung tõm chẩn
ủoỏn thỳ y trung ương Ờ Cục thỳ y.
- Sử dụng virut Newcastle cường ủộc chủng VN91 tiờm dưới da với liều 200 LD50 / 1 ủà ủiểu. Theo dừi cỏc biểu hiện triệu chứng và bệnh tớch, Hàm lượng khỏng thể trước và sau khi cụng.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 44
3.4.5. Phương phỏp xử lý số liệu
Cỏc số liệu thu thập ủược, ủược sử lý theo phương phỏp thống kờ sinh học trờn chương trỡnh Excel và Minitab 15.1, so sỏnh theo phương phỏp giỏ trị
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 45
Phần 4. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. đÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA đÀ đIỂU VỚI VACXIN NEWCASLE
Chỳng tụi ủó tiến hành nghiờn cứu ủỏp ứng miễn dịch của ủà ủiểu sinh sản với vacxin Newcastle và sự tương quan giữa hàm lượng khỏng thể của ủà
ủiểu mẹ với khỏng thể thụủộng ởủà ủiểu con 1 ngày tuổi và thu ủược kết quả
như sau:
4.1.1. đỏp ứng miễn dịch của ủà ủiểu sinh sản với vacxin Newcastle
để phũng bệnh Newcastle cú hiệu quả, thỡ biện phỏp quyết ủịnh là sử
dụng vacxin tạo miễn dịch chủ ủộng cho ủà ủiểu, trong quỏ trỡnh sử dụng vacxin thỡ cú nhiều yếu tố ảnh hưởng ủến khả năng sản sinh khỏng thể ủặc hiệu, trong ủú cú yếu tố liều lượng vacxin (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)[17, 30]. Liều lượng vacxin phải thớch hợp thỡ khỏng thể mới sinh ra nhiều.
đà ủiểu thuộc lớp chim nhưng cú khối lượng rất lớn (110-170 kg) vỡ vậy khi phũng cho chỳng bằng vacxin ủặc hiệu cho gà cần phải xỏc ủịnh liều lượng phự hợp ủể cho ủỏp ứng miễn dịch tốt nhất. để chọn lựa liều vacxin thớch hợp tiờm cho ủà ủiểu sinh sản, dựa trờn cơ sở quy trỡnh sử dụng vacxin của Trung tõm nghiờn cứu gia cầm Thụy Phương và quy trỡnh sử dụng vacxin của Trung quốc. Chỳng tụi tiến hành bố trớ thớ nghiệm trờn ủàn ủà ủiểu sinh sản, vào thời ủiểm trước khi vào vụ ủẻ, gồm 18 ủà ủiểu sinh sản ủược chia làm 3 lụ ( Lụ I, Lụ II, Lụ III ) và tiờm vacxin với cỏc liều khỏc nhau (1ml; 2ml; 5ml) tương ứng với 2 liều; 4 liều và 10 liều sử dụng cho gà. Trước và sau khi tiờm vacxin 30 ngày (tớnh từ thời ủiểm tiờm vacxin) lấy mỏu chắt huyết thanh ủể kiểm tra hàm lượng khỏng thể thụng qua hiệu giỏ của phản
ứng HI. Kết quả thu ủược trỡnh bày ở bảng 4.1.
Kết quả cho thấy, Sau 30 ngày tiờm vacxin Medivac ND Emulsion ủà
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 46
sau khi tiờm vacxin 30 ngày, hiệu giỏ HI bỡnh quõn ủạt 8,17 ổ 0,31 log2, 100% số mẫu huyết thanh kiểm tra cú hiệu giỏ HI ≥ 4 log2.
- Ở lụ II, sử dụng 4 liều gà (2 ml ) sau khi tiờm vacxin 30 ngày, hiệu giỏ HI bỡnh quõn ủạt 10,17 ổ 0,31 log2, 100% số mẫu huyết thanh kiểm tra cú hiệu giỏ HI ≥ 4 log2.
- Ở lụ III, sử dụng 10 liều gà (5 ml ) sau khi tiờm vacxin 30 ngày, hiệu giỏ HI bỡnh quõn ủạt 10,00 ổ 0,52 log2, 100% số mẫu huyết thanh kiểm tra cú hiệu giỏ HI ≥ 4 log2.
Bảng 4.1. Hàm lượng khỏng thể Newcastle ởủà ủiểu sinh sản khi tiờm vacxin ND Emulsion với liều khỏc nhau
Hiệu giỏ HI (log2) bỡnh quõn (X ổ mx)
Lụ
TN n vacxin Liều
Trước khi tiờm Sau khi tiờm vacxin 30 ngày
Tỷ lệ (%) HI ≥ 4 log2
I 6 1 ml 5,33 ổ 0,42 8,17a ổ 0,31 100 II 6 2 ml 5,33 ổ 0,33 10,17b ổ 0,31 100 III 6 5 ml 5,17 ổ 0,40 10,00b ổ 0,52 100
Ghi chỳ: TN: thớ nghiệm; cỏc số trong cựng 1 cột mang chữ cỏi khỏc nhau thỡ khỏc nhau cú ý nghĩa thống kờ.
So sỏnh hiệu giỏ HI (log2) bỡnh quõn tại thời ủiểm sau khi tiờm vacxin 30 ngày ở 3 lụ cho thấy giữa lụ I với lụ II và lụ III cú sự sai khỏc. Lụ I cú hiệu giỏ HI bỡnh quõn thấp hơn lụ II và lụ III, so sỏnh giữa lụ II và lụ III thấy hiệu giỏ HI (log2) bỡnh quõn là tương ủương nhau ở thời ủiểm sau 30 ngày tiờm vacxin (p<0,05).
Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978)[17, 30] cho biết, số lượng virut trong vacxin cú ảnh hưởng ủến lượng khỏng thể Newcastle ủược sinh ra. Lượng khỏng nguyờn càng nhiều thỡ lượng khỏng thể càng tăng cao. Tuy nhiờn cú
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 47
giới hạn nhất ủịnh, nếu khỏng nguyờn quỏ nhiều sẽ gõy ức chế miễn dịch. Liều lượng khỏng nguyờn (vacxin) phải thớch hợp thỡ khỏng thể mới sinh ra nhiều. Từ kết quả thực nghiệm trờn chỳng tụi nhận thấy liều vacxin thớch hợp sử dụng tiờm cho ủà ủiểu sinh sản là 2 ml / con (4 liều gà). Kết quả nghiờn cứu này cũng phự hợp với liều vacxin theo khuyến cỏo của Alexander (2000) và Fan Jishan (2004)[30];[9], ủú là tiờm 2 ml Ờ 5 ml / con với vacxin nhũ dầu hàng năm cho ủàn ủà ủiểu sinh sản.
4.1.2. Diễn biến hàm lượng khỏng thể chủủộng Newcastle ởủà ủiểu mẹ
Diễn biến hàm lượng khỏng thể chủ ủộng Newcastle của ủà ủiểu mẹ
sau khi tiờm vacxin cú vai trũ quan trọng trong việc xỏc ủịnh thời ủiểm thớch hợp ủể tiờm phũng nhắc lại, tạo miễn dịch chủ ủộng liờn tục cú khả năng bảo vệ khi cú sự tấn cụng của virut Newcastle cường ủộc. Chớnh vỡ vậy việc nghiờn cứu diễn biến hàm lượng khỏng thể sau khi tiờm vacxin Newcastle cho
ủà ủiểu mẹ là rất cần thiết ủể từủú ủưa ra ủược quy trỡnh sử dụng vacxin thớch hợp, ủảm bảo an toàn cho ủà ủiểu sinh sản.
để nghiờn cứu chỉ tiờu này, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt trờn 10 ủà ủiểu mỏi sau khi tiờm vacxin Medivac ND Emulsion (tiờm dưới da cỏnh) với liều 2 ml / con ( gấp 4 liều gà), vào thời ủiểm trước vụủẻ 1 thỏng, hiệu giỏ HI bỡnh quõn trước khi tiờm vacxin ủạt 5,8 ổ 0,33 log2) và 100% số mẫu huyết thanh kiểm tra cú hiệu giỏ HI ≥ 4 log2. Sau khi tiờm vacxin 1 thỏng; 3 thỏng; 6 thỏng; 8 thỏng; 9 thỏng và 12 thỏng, chỳng tụi tiến hành lấy mỏu chắt huyết thanh làm phản ứng HI ủể xỏc ủịnh hàm lượng khỏng thể Newcastle. Kết trỡnh bày ở bảng 4.2.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 48
Bảng 4.2. Diễn biến khỏng thể Newcastle của ủà ủiểu mẹ sau khi tiờm vacxin ND Emulsion Hiệu giỏ HI (log2) Thời gian sau khi tiờm vacxin (thỏng) n 4 5 6 7 8 9 10 11 Hiệu giỏ HI bỡnh quõn (X ổ mx) HI ≥ 4 log2 (%) 1 10 2 7 1 9,9 ổ 0,18 100 3 10 1 3 4 2 8,7 ổ 0,30 100 6 10 3 5 2 7,9 ổ 0,23 100 8 10 2 6 2 7,0 ổ 0,21 100 9 10 1 1 4 4 6,5 ổ 0,21 100 12 10 1 3 2 4 5,6 ổ 0,27 100 Kết quả cho thấy: đà ủiểu cú ủỏp ứng miễn dịch cao nhất ở thời ủiểm sau 1 thỏng tiờm vacxin, sau ủú khỏng thể giảm dần.
- Sau khi tiờm vacxin 1 thỏng, cỏc mẫu huyết thanh kiểm tra ủều cú hiệu giỏ HI cao từ 9 log2 ủến 11 log2, HI bỡnh quõn ủạt 9,9 ổ 0,18 (log2), 100%
ủà ủiểu cú khỏng thể chống bệnh Newcastle trong mỏu với hàm lượng cao. Như vậy 100% sốủà ủiểu theo dừi ủược bảo hộ với bệnh ở mức ủộ cao.
Diễn biến khỏng thể của ủà ủiểu sinh sản 5.80 9.90 8.70 7.90 7.00 6.50 5.60 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 tr−ớc khi tiêm 1tháng 3thá ng 6thá ng 8thá ng 9thá ng 12th áng thỏng H I (l o g 2 ) HI
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 49
- Khảo sỏt hàm lượng khỏng thểở cỏc thời ủiểm sau khi tiờm vacxin 3 thỏng; 6 thỏng; 8 thỏng; 9 thỏng và 12 thỏng, chỳng tụi thấy hàm lượng khỏng thể này giảm dần, với hiệu giỏ HI bỡnh quõn lần lượt tương ứng là: 8,7ổ0,30 (log2); 7,9 ổ 0,23 (log2); 7,0 ổ 0,21 (log2); 6,5 ổ 0,21 (log2) và 5,6 ổ 0,27 (log2), với 100% số mẫu kiểm tra cú hiệu giỏ HI ≥ 4 log2 ở cỏc thời ủiểm trờn. Như vậy qua kết quả khảo sỏt cho thấy ủà ủiểu mẹ cho ủỏp ứng miễn dịch cao sau khi tiờm vacxin và miễn dịch cú khả năng bảo hộ bệnh kộo dài 12 thỏng.
Như vậy ở ủà ủiểu sinh sản vacxin Newcastle chỉ cần tiờm 1 lần ủủủể
cú miễn dịch bảo hộ với bệnh trong vũng 1 năm.
Từ kết quả nghiờn cứu thực nghiệm chỳng tụi ủưa ra kết luận. lịch phũng vacxin Newcastle thớch hợp cho ủà ủiểu sinh sản là tiờm 1 lần / năm với liều 2 ml / con, ủủủểủà ủiểu cú miễn dịch bảo hộ với bệnh Newcastle.
Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi cũng phự hợp với kết quả nghiờn cứu và khuyến cỏo của một số tỏc giả trờn thế giới như: Fan jishan (2004)[9], Perelman (2000)[77], ủú là ở ủà ủiểu sinh sản vacxin Newcastle chỉ cần tiờm 1 lần / năm vào mựa ủụng. Do ủú chỳng tụi tiến hành tiờm ủại trà cho toàn