4. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.3.1 Tỡnh hỡnh bệnh mốc sương P.infestans hại khoai tõy, cà chua cỏc tỉnh phớa
phớa bắc vụ ủụng xuõn 2009-2010.
Bệnh mốc sương cà chua khoai tõy cú thể coi là một trong những căn bệnh nguy hiểm nhất ủối với ngành sản xuất khoai tõy cà chua. Bệnh khi xuất hiện trờn
ủồng ruộng sẽ ớt nhiều ảnh hưởng tới năng suất. Bệnh nhẹ hại trờn bộ lỏ làm giảm diện tớch quang hợp giảm năng suất của cõy. Bệnh hại nặng làm chết toàn bộ cõy mất hoàn toàn năng suất. Hơn nữa bệnh cú khả năng tồn tại trong củ giống, củ
thương phẩm là nguồn bệnh cho vụ sau. Ở miền bắc nước ta trong vụủụng xuõn cà chua là một trong những cõy trồng chủ yếu, khoai tõy cũng ủó ủược trồng trong vụủụng từ khỏ lõu hiện nay do nhu cầu tăng cao diện tớch trồng khoai tõy, cà chua
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 66
ủang ủược mở rộng. Trong vụủụng xuõn 2009-2010 vừa qua cụng ty Orion Vina cộng tỏc với Viện sinh học nụng nghiệp trồng phổ biến giống khoai Atlantic tại một số tỉnh như Lạng Sơn, Hải Phũng, Bắc Ninh....
ðiều tra tỡnh hỡnh bệnh mốc sương hại cà chua khoai tõy ở một số tỉnh phớa bắc Việt Nam trong vụ ủụng xuõn năm 2009-2010 chỳng tụi thu ủược kết quả thể hiện ở bảng 4.10 :
Bảng 4.10. Tỡnh hỡnh bệnh mốc sương hại cà chua, khoai tõy tại một số tỉnh phớa bắc Việt Nam vụ ủụng xuõn năm 2009-2010.
ðịa ủiểm Mức ủộ phổ biến Thời ủiểm xuất hiện (thỏng)
Cao Lộc, Lạng Sơn ++ 12,1,2,3
An Lóo, Hải Phũng ++ 1,2
Yờn Phong, Bắc Ninh + 12,1,2
Gia Lõm, Hà Nội + 1,2
Ghi chỳ: MðPB: Mức ủộ phổ biến.
+ : tỷ lệ bệnh <10% +++ : tỷ lệ bệnh <26 - 50% ++ : tỷ lệ bệnh <11% - 25% ++++ : tỷ lệ bệnh >50%
Triệu chứng bệnh trờn ủồng ruộng: Lỳc ủầu bệnh thường xuất hiện ở mộp lỏ, cuống lỏ sau ủú lan rộng vào phiến lỏ tạo thành những ủỏm mụ bị thối nõu, khi trời ẩm ướt mặt dưới lỏ chỗ cú vết bệnh xuất hiện lớp nấm trắng xốp như sương muối ủú là ủỏm cành bào tử phõn sinh và bào tử phõn sinh của nấm gõy bệnh. Cũn ở trờn thõn, bị bệnh từng ủoạn dài, vỏ và ruột phần thõn thối ướt màu nõu
ủen, chỗ bị bệnh nhỏ túp lại cú khi chỉ một phớa thõn bị thối, khi ẩm ướt, trờn vết bệnh cú lớp nấm trắng như sương muối bao phủ, cành thõn bị bệnh rễ góy gục làm tan cõy xơ xỏc. ðiều này thấy rất rừ ở những thời ủiểm như ủầu thỏng 1 ủến cuối thỏng 1, cuối thỏng 2 cho ủến giữa thỏng 3, khi mà nhiệt ủộ hạ thấp ủồng thời cú nhiều mưa phựn và sương mự.
Trong cỏc ủịa phương ủiều tra, giống khoai chủ yếu là giống Atlantic và một số giống khoai tõy nhập từ Trung Quốc. Bệnh mốc sương gõy hại trờn cả hai giống khoai tõy này với tỉ lệ bệnh từ trung bỡnh tới cao.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 67
Tại Lạng Sơn bệnh gõy hại vào cuối thỏng 12 và kộo dài tới thỏng 3 năm sau. Tại Gia Lõm, Hà Nội bệnh hại xuất hiện với mức ủộ nhẹ. Bệnh vẫn cũn rải rỏc vào thỏng 3 nhưng do nhiệt ủộ cao lờn nhanh chúng cỏc vết bệnh nhanh chúng bị khụ ủi, cựng với việc ỏp dụng biện phỏp phun thuốc hoỏ học (Ridomil Gold-Syngenta) bệnh nhanh chúng ủược loại bỏ khỏi ủồng ruộng.
Hỡnh 4.4: Ruộng khoai bị bệnh mốc sương
4.3.2 ðỏnh giỏ tớnh khỏng nhiễm trờn cõy in vitro của cỏc dũng khoai tõy nhị bội ủối với nấm P. infestans.
Nấm p.infesant cú khả năng hỡnh thành nhiều chủng (race) khỏc nhau. Dựa trờn lý thuyết “gen ủối gen” (Flor,1952), ủó xỏc ủịnh nấm gồm cú 16 nũi trong ủú bao gồm cỏc chủng ủơn và chủng hỗn hợp. Tuy nhiờn số lượng chủng nấm thay
ủổi phụ thuộc vào khu vực sinh thỏi trồng trọt hoặc ở mỗi nước khỏc nhau [23].
Một giống (dũng) khoai tõy cú thể nhiễm với chủng nấm ở vựng sinh thỏi này nhưng lại cú thể khỏng với chủng nấm ở vựng sinh thỏi khỏc. Vỡ vậy ủể tạo ủược những giống khoai tõy chống chịu nấm p.infesant bằng kỹ thuật dung hợp tế bào trần cho một khu vưc sinh thỏi, trước hết cần khảo sỏt tớnh khỏng nhiễm của cỏc dũng nhị bội với cỏc chủng nấm thu thập ủược tại vựng sinh thỏi ủú.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 68
Khảo nghiệm tớnh khỏng nhiễm trờn cõy in vitro của cỏc dũng khoai tõy nhị bội ủối với 2 mẫu nấm P. infestans chỳng tụi thu ủược kết quả thể hiện ở
bảng 4.11 và biểu ủồ 4.4.
Bảng 4.11: Tớnh khỏng nhiễm trờn cõy in vitro của cỏc dũng khoai tõy nhị bội ủối với nấm P. infestans.
Tom-GL-09 Pot-YP-09 Tờn Dũng Tktd (ngày) TLB (%) Tủ KN Tktd (ngày) TLB (%) Tủ KN Atlantic 3 88,23 9 Nn 3 97,05 9 Nn Pt771 3 33,3 5 Nv 3 38,89 5 Nv Pt772 3 35,29 5 Nv 3 47,06 6 Nn Pt773 3 58,82 7 Nn 3 67,64 8 Nn Ratte 4 17,67 3 N 4 19,33 3 N Pnt 2G 5 8,25 2 K 5 9,38 2 K Trn3G 5 7,3 2 K 5 8,98 2 K Ghi chỳ : Tktd : Thời kỳ tiềm dục Tủ : thang ủiểm TLB : Tỷ lệ bệnh KN : Tớnh khỏng nhiễm Nn : nhiễm nặng ; Nv : nhiễm vừa N : nhiễm nhẹ ; K : khỏng 0 20 40 60 80 100 Atlantic Pt771 Pt772 Pt773 Ratte Pnt 2G Trn3G Tờn dũng Tỉ lệ bệnh (%) tom TLB (%) pot TLB (%)
Biểu ủồ 4.4: Tớnh khỏng nhiễm trờn cõy in vitro của cỏc dũng khoai tõy nhị bội ủối với nấm P. infestans.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 69
Qua bảng 4.11 và biểu ủồ 4.4 cho thấy:
- Giống khoai tõy trồng Atlantic (ủối chứng) cú tỷ lệ nhiễm bệnh cao với cả hai mẫu nấm (88,23; 97,05) chứng tỏ mẫu nấm phõn lập ủược cú khả năng lõy nhiễm, ủủ ủiều kiện sử dụng ủể ủỏnh giỏ tớnh khỏng của cỏc dũng khoai tõy nhị
bội.
- Cỏc dũng khoai tõy nhị bội Pt của CIP ủều nhiễm với cả hai mẫu nấm, tỷ lệ
nhiễm từ 33,3 ủến 67,64, thời kỳ tiềm dục là 3 ngày. Trong 3 dũng Pt, dũng Pt771, Pt772 nhiễm vừa, dũng Pt 773 nhiễm nặng. Cỏc cõy nhiễm bệnh nhanh chúng chết lụi.
- Hai dũng khoai tõy dại của ðức Pnt 2G, Trn 3G thể hiện tớnh khỏng với cả hai mẫu nấm. Dũng Pnt 2G (8,25; 9,38), dũng Trn 3G (7,3; 8,98), thời kỳ tiềm dục của hai dũng với hai mẫu nấm là 5 ngày.
- Dũng Ratte nhiễm nhẹ với 2 mẫu nấm tỷ lệ bệnh (17,67; 19,33), thời kỳ tiềm dục là 4 ngày.
- Tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh khi lõy nhiễm với mẫu nấm Tom-GL-09 ủều thấp hơn so với mẫu nấm Pot- YP-09.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 70
Kiểm tra
Mẫu bệnh thu thập ngoài ủồng ruộng Bào tử nấm p.infestans
Phõn lập
Nhõn nguồn
Nhõn nguồn bằng lỏ khoai tõy Nấm p.infestans trờn mụi trường nhõn tạo
Lõy nhiễm
Cõy khoai tõy in vitro Cõy khoai tõy in vitro trước khi lõy nhiễm sau khi lõy nhiễm
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 71
4.2.3 ðỏnh giỏ tớnh khỏng nhiễm trờn củ của cỏc dũng khoai tõy nhị bội ủối với nấm P. infestans.
Tớnh khỏng nhiễm của củ là một trong những chỉ tiờu ủược quan tõm nhất khi ủỏnh giỏ khả năng khỏng nhiễm của một giống khoai tõy. Củ khoai tõy nhiễm bệnh sẽ làm giảm giỏ trị thương phẩm, củ giống nhiễm bệnh sẽ là nguồn qua ủụng và truyền lan nguy hiểm tới cỏc vụ sau. Củ khoai tõy nhiễm bệnh cũn là nguồn phỏt tỏn từ vựng ủịa lý này sang vựng ủịa lý khỏc của nấm mốc sương.
Thử nghiệm tớnh khỏng nhiễm mốc sương trờn 5 dũng khoai tõy nhị bội: Pt-771; Pt-772; Pt-773; Ratte D,Avignom; Pnt 3G; và Giống khoai tõy Atlantic làm ủối chứng với 2 mẫu nấm P. infestans bằng ủỏnh giỏ tớnh khỏng nhiễm trờn toàn củ và tớnh khỏng nhiễm trờn lỏt củ khoai tõy.
* Tớnh khỏng nhiễm toàn củ
Thử nghiệm tớnh khỏng trờn củ khoai tõy giống của cỏc dũng khoai tõy nghiờn cứu với 2 isolate nấm thu thập ủược chỳng tụi thu ủược kết quả thể hiện
ở bảng 4.12 và biểu ủồ 4.5
Bảng 4.12: Tớnh khỏng nhiễm toàn củ của cỏc dũng khoai tõy ủối với nõm P. infestans
Tỉ lệ củ giống nhiễm bệnh sau 7 ngày (%) Tờn Dũng
Tom-GL-09 Pot- YP-09
Atlantic 98.33 98.33 Pt771 41.67 50.00 Pt772 58.33 71.67 Pt773 70.00 83.33 Ratte 18.33 21.67 Pnt2G 1.67 3.33
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 72 0 20 40 60 80 100 Atlantic Pt771 Pt772 Pt773 Ratte Pnt2G Tờn dũng T ỷ l ệ b ệ nh Tom Pot
Biểu ủồ 4.5: Tớnh khỏng nhiễm toàn củ của cỏc dũng khoai tõy ủối với nấm
P. infestans
Qua bảng 4.12 và biểu ủồ 4.5 cho thấy:
- Cỏc dũng khoai tõy Pt, ủều nhiễm bệnh ở mức ủộ khỏc nhau. Dũng Pt773 nhiễm mức ủộ cao nhất, 70.00% với mẫu nấm Tom và 83.33% với mẫu nấm Pot.
- Dũng Ratte nhiễm nhẹ, tỷ lệ nhiễm bệnh là 18.33% với mẫu nấm Tom và 21.67% với mẫu nấm Pot.
- Dũng Pnt 2G thể hiện tớnh khỏng cao với cả 2 mẫu nấm, tỷ lệ củ giống nhiễm bệnh là 1.67% với mẫu nấm Tom và 3.33% với mẫu nấm Pot.
- Tỷ lệ củ giống nhiễm bệnh với mẫu nấm Pot (thu trờn khoai tõy) ủều cao hơn so với mẫu nấm thu trờn cà chua.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 73
* Tớnh khỏng nhiễm trờn khoanh củ
Thử nghiệm tớnh khỏng trờn khoanh củ khoai tõy của cỏc dũng khoai tõy nghiờn cứu ủối với 2 mẫu nấm, chỳng tụi thu ủược cỏc kết quả thể hiện ở bảng 4.13 và biểu ủồ 4.6
Bảng 4.13: Tớnh khỏng nhiễm trờn khoanh củ của cỏc dũng khoai tõy ủối với nõm P. infestans
Tỉ lệ khoanh củ nhiễm bệnh sau 7 ngày (%) Tờn Dũng
Tom-GL-09 Pot- YP-09
Atlantic 98.89 100.00 Pt771 44.44 48.89 Pt772 80.00 81.11 Pt773 86.67 88.89 Ratte 30.00 33.33 Pnt2G 3.33 5.56 0 20 40 60 80 100 Atlantic Pt771 Pt772 Pt773 Ratte Pnt2G Tờn dũng T ỷ l ệ b ệ nh Tom Pot
Biểu ủồ 4.6: Tớnh khỏng nhiễm trờn khoanh củ của cỏc dũng khoai tõy ủối với nõm P. infestans
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 74
Qua bảng 4.13 và biểu ủồ 4.6 cho thấy:
Thớ nghiệm trờn khoanh củ cũng cho kết quả tương tự với thớ nghiệm trờn toàn củ. Tuy nhiờn tỷ lệ nhiễm bệnh trờn khoanh củ cao hơn tỷ lệ nhiễm trờn toàn củ.
Hỡnh 4.5 : Triệu chứng bệnh mốc sương khi lõy nhiễm trờn lỏt củ.
Kết luận:
- Trong 6 dũng khoai tõy khảo sỏt cú 2 dũng Ptn 2G, Trn 3G thể hiện tớnh khỏng cao với nấm mốc sương. Dũng Ratte thể hiện tớnh nhiễm nhẹ. Cỏc dũng khoai tõy Pt của CPI nhiễm bệnh ở mức ủộ khỏc nhau, dũng Pt 771, Pt 772 nhiễm vừa, Pt773 nhiễm nặng.
- Khả năng nhiễm bệnh khi lõy nhiễm với mẫu nấm thu từ khoai tõy cao hơn so với mẫu nấm thu từ cà chua.
4.3. ðỏnh giỏ khả năng khỏng virus của cỏc dũng khoai tõy nhị bội thụng
qua chỉ thị phõn tử
Trong genom khoai tõy người ta ủó phỏt hiện cú một số loại gen cú khả năng khỏng lại bệnh virus Y, ủú là loài S.stolonierum cú chứa gen Rysto , Rystona
, Rystorns; loài S.tuberosum spp.Andigena cú chứa Ryadg; loài S.demisum cú chứa gen Nydms; loài S.hougasi cú chứa gen Ryhou ... Trong cỏc gen khỏng PVY, gen Rysto là một gen cú nguồn gốc từ loài S.stolonierum cho khả năng khỏng rất cao ủối với tất cả cỏc chủng PVY. Hơn nữa khụng chỉ khỏng PVY mà gen Rysto cũn cho phộp cỏc dũng, giống khoai tõy chứa nú khỏng ủược một số loại virus khỏc nữa như PVA, PVV. Vỡ vậy gen này ủược cỏc nhà nghiờn cứu ủặc biệt quan tõm.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 75
Ye-Su Song và cộng sự (2005) [79] ủó sử dụng 12 mồi AFLP và phõn tớch trờn 106 mẫu giống khoai tõy cú nguồn gốc từðức, Hà Lan, Ba Lan ủểủịnh vị
gen Pysto và kết luận locus của gen Rysto nằm ở trờn nhiễm sắc thể XII và ủược phỏt hiện bởi mồi SSR STM0003 – 111. Mồi STM 003 - 111 nhõn ủoạn ADN cú kớch thước 111bp cựng nằm trờn NST XII và liờn kết rất chặt với gen Rysto.
Gen Nb là một gen trội cho phộp khoai tõy cú khả năng khỏng cao với cỏc chủng PVX thuộc nhúm 1 (chủng PVX ROTH1), nhúm 2 (chủng PVY CP2). Marano và cộng sự (2002) [65] ủó xỏc ủịnh ủược vị trớ của gen Nb nằm ở vị trớ 0.76 cM trờn NST số V, giữa 2 marker AFLP GM339, GM637. Marker GM339 nhõn ủoạn ADN cú kớch thước 330bp liờn kết rất chặt với gen Nb.
Từ những kết quả thu thập ở trờn chỳng tụi ủó sử dụng mồi GM3339 ủể phỏt hiện ra gen khỏng virus PVX, mồi STM0003-111 ủể phỏt hiện ra gen khỏng PVY.
4.3.1. ðỏnh giỏ ủộ tinh sạch của ADN
Sản phẩm ADN tỏch chiết ủược ủiện di kiểm tra trờn gel agarose 1%. Qua ảnh ủiện di ADN tổng số của 6 mẫu khoai tõy, ta thấy cả 6 mẫu ủều xuất hiện 1 băng ADN chứa ADN tổng số và ADN bị ủứt góy rất ớt. Như vậy ADN tổng số của 6 giống ủỏp ứng ủược yờu cầu của cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
Hỡnh 4.6: Ảnh ủiện di ADN tống số
Chỳ thớch:
1 2 3 4 5 6
Pt771 Pt772 Pt773 Ratte Pnt2G Trn3G
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 76
4.3.2. Kết quả phản ứng PCR
Kết quả phản ứng PCR ủược thể hiện ở sự xuất hiện cỏc băng ADN trờn bản gel ủiện di. Mỗi ủoạn ADN ủược nhõn lờn sẽ cho 1 vạch cú vị trớ nhất ủịnh trờn bản gel. Cỏc mồi khỏc nhau ủó cho kết quả cỏc vạch băng nhõn lờn khỏc nhau ủược thể hiện qua bảng 14.
Cặp mồi GM3339 Cặp mồi STM0003-111
Hỡnh 4.7: Ảnh ủiện di sản phẩm PCR
Chỳ thớch:
1 2 3 4 5 6
Pt771 Pt772 Pt773 Ratte Pnt2G Trn3G
Hỡnh ảnh ủiện di sản phẩm PCR ủược minh họa ở hỡnh 4.5. Qua kết quả
phản ứng PCR ta thấy:
- Khi sử dụng mồi GM339, những dũng khoai tõy cú ủoạn ADN ủược nhõn lờn với kớch thước 330bp, ủỳng như kớch thước của ủoạn ADN liờn kết chặt với gen Nb - gen khỏng virus PVX là những dũng cú chứa gen Nb. Trong 6 dũng khoai tõy nhị bội nghiờn cứu cú 2 dũng cú chứa gen Nb và như vậy cú khả
năng khỏng virus PVX, ủú là: Pt771, Pt772. 330bp 1 2 3 4 5 6 ladder 500bp Ladder1 2 3 4 5 6 111bp
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 77
- Khi sử dụng mồi STM0003-111, những dũng khoai tõy cú ủoạn ADN
ủược nhõn lờn với kớch thước 111bp, ủỳng như kớch thước của ủoạn ADN liờn kết chặt với gen Rysto - gen khỏng virus PVY là những dũng cú chứa gen Rysto. Trong 6 dũng khoai tõy nhị bội nghiờn cứu cú 3 dũng cú chứa gen Rysto và như
vậy cú khả năng khỏng virus PVY, ủú là: Pt771 Pt772, Ratte.
Bảng 14: Số lượng cỏc băng ADN nhõn ủược của cỏc mồi với mỗi dũng khoai tõy nhị bội
Số lượng cỏc băng ADN Tờn Dũng GM3339 STM0003-111 Tổng Pt771 2 2 4 Pt772 2 2 4 Pt773 1 2 3 Ratte 0 2 2 Pnt2G 0 0 0 Trn3G 0 1 1
Sau khi sử dụng cỏc marker phõn tử ủể phỏt hiện ra gen khỏng virus PVX và