2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.6. Cỏc nghiờn cứu tạo giống khoai tõy khỏng bệnh mốc sương, bệnh virus
trong và ngoài nước.
2.6.1. Cỏc nghiờn cứu tạo giống khoai tõy khỏng bệnh mốc sương.
Theo Thieme et al.(2008) chứng minh loài khoai tõy dại S. tarnii là nguồn gen khỏng quan trọng với cả sõu hại và bệnh hại, biểu hiện tớnh rất khỏng với virus PVY, tớnh khỏng cao với nấm Phytopthera infestans. S. tarnii dũng nhị bội (2n = 2x = 24), cú củ thuộc nhúm Pinnatisecta, nguồn gốc từ Mexican ủược tạo ra từ khoai tõy tứ bội (2n = 4x = 48) S. tuberosum. đõy là nguồn gen khỏng tiềm năng với tỏc nhõn gõy bệnh phục vụ cụng tỏc chọn tạo giống.
Cỏc nghiờn cứu và lai tạo giống của trường ủại học Cornell (Mỹ) ủó ủưa ra giống khoai tõy NewYork 128 cú khả năng khỏng bệnh mốc sương và cũn cú khả năng khỏng tuyến trựng ỏnh vàng hại khoai tõy cung cấp cho ngành nụng nghiệp nước Nga. Một số giống cà chua như Legend cũng ủược cụng bố cú khả
năng khỏng mốc sương nhưng cỏc thử nghiệm ủồng ruộng ủó cho thấy giống khỏng kộm khi ỏp lực bệnh lờn quỏ cao. Một số giống cà chua bi như sweetie,
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 28
red cherry cú khả năng chịu bệnh tốt.
Nấm mốc sương cú khả năng gõy hại trờn nhiều giống khoai tõy, cà chua với cỏc tỉ lệ hại khỏc nhau. Nghiờn cứu của đào Mạnh Hựng và CTV (1995) thỡ trờn cỏc giống Ba Lan, giống Hồng Lan bị bệnh mốc sương phỏ hại nặng, giống HP1, HP5 cú khả năng chống chịu bệnh khỏ lớn Cũn theo Vũ Tuyờn Hoàng và CTV (1982) cỏc giống nhập nội từ chõu Âu như: Hungari, Bungari, Liờn Xụ cũ
thường bị nặng và tốc ủộ phỏt triển bệnh cũng khỏ nhanh, một số giống khoai tõy đức nhập nội như: Cardia, Mariella, Giống khoai tõy Phỏp (Ackesergen), giống Thường TớnẦủều là những giống nhiễm bệnh nặng. Một số giống khoai tõy nhập nội từ trung tõm khoai tõy quốc tế
(CIP) bao gồm: LBR1-2, LBR1-5, LBR1-9, LBR1-12, LBR1-13,và LBR1-14 là những giống chống bệnh mốc sương (Vũ Triệu Mõn, Lờ Lương Tề, 1998).
2.6.2.Cỏc nghiờn cứu tạo giống khoai tõy khỏng bệnh virus.
Cỏc nghiờn cứu về phõn loại, di truyền thực vật và nghiờn cứu ở mức phõn tửủó xỏc ủịnh ủược 206 loài khoai tõy dại mang củ, 7 loài nguyờn thủy và một loài khoai tõy trồng Solanum spp, cũng như một số loài dại khụng mang củ
cú ủặc tớnh khỏng virus tốt theo spooner và Hijmans (2001). Chỳng ủược thu thập và thăm dũ về tớnh khỏng virus và cỏc tỏc nhõn gõy bệnh khỏc kể cả sõu hại. đõy là nguồn gen khỏng quan trọng cho những nhà chọn tạo giống khoai tõy khỏng virus, nhằm tập hợp nhiều gen khỏng vào loài khoai tõy trồng nào ủú. Cỏc nhà nghiờn cứu về khoai tõy ở Chõu Âu khẳng ủịnh 90% loài khoai tõy dại trong quỹ gen thu thập là nguồn gen khỏng mới cú ý nghĩa.
Cú nhiều phương phỏp ủể tạo giống khoai tõy khỏng virus như lai hữu tớnh giữa cỏc dũng khoai tõy cú ủặc tớnh khỏng virus với nhau, chuyển gen khỏng virus vào khoai tõy trồng, dung hợp tế bào trần (lai soma) giữa cỏc loài mà gặp khú khăn trong lai hữu tớnh. Tuy nhiờn phương phỏp lai hữu tớnh gặp rất nhiều khú khăn do sự sai khỏc về mặt di truyền, thời gian lõu và dễ mất ủi một số ủặc tớnh tốt của bố mẹ ủem lai. đối với phương phỏp chuyển gen cũng gặp
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 29
khụng ớt rắc rối bởi tớnh khỏng virus do một hay nhiều gen quy ủịnh, ủồng thời là khỏng ủặc hiệu dũng virus Theo Cockerham (1970); Ross (1986); Jones (1990); Mendoza et al. (1990) dễ tạo ra cỏc chủng virus mới, ngoài ra cũn cú sự
tương tỏc giữa prtotein của gen chuyển và gen virus, sự tỏi tổ hợp giữa mRNA của gen chuyển và genome virus hay sự cú mặt gen chuyển trong loài cỏ
dạiẦHướng tạo giống khỏng bằng dung hợp tế bào trần cú rất nhiều ưu ủiểm như: Tổ hợp bộ genome của cả hai bố mẹ lai tạo thành một cấu trỳc genome dị
hợp tử mới khụng cú sự biệt lập trong quỏ trỡnh giảm phõn, rỳt ngắn thời gian lai tạo, khắc phục những rào cản về mặt di truyền trong lai hữu tớnhẦ Cho nờn trở thành cụng cụủầy hứa hẹn phục vụ chương trỡnh chọn tạo giống của cõy sinh sản sinh dưỡng như cõy khoai tõy.
Bờn cạnh việc tạo giống khỏng virus cần tạo giống khỏng cụn trựng truyền virus. Bởi cụn trựng chớnh là vector truyền bệnh virus nguy hiểm cần chủ ủộng tiờu diệt và phũng trừ. Tớnh khỏng cụn trựng truyền bệnh virus dựa trờn tổ hợp nhiều yếu tố khỏc nhau như yếu tố húa sinh và ủặc ủiểm hỡnh thỏi (cú lụng), ủặc biệt là thành phần glycoalkaloid. Theo nghiờn cứu Tingey et al. (1978) và Sinden (1982) cho biết hàm lượng glycoalkaloid cao cú vai trũ quan trọng trong cõy khoai tõy khỏng cụn trựng truyền bệnh, hợp chất này gõy ủộc với một số loài cụn trựng cỏnh cứng (beetle-insect) ăn lỏ (levinson 1976; Raman eta al. 1979; Sanford et al. 1996). Một số loài khoai tõy dại S. berthaultii, S. polyadenium, S.
wittmackii và S. tarijense cú ủặc ủiểm mang nhiều lụng, cú tuyến dớnh trờn lỏ và thõn do ủú làm giảm tớnh ăn của loài rệp Macrosiphum persicae nờn ủó hạn chế
sự truyền bệnh virus, nhất là virus PVY (Gunenc và Gibson 1980). Ngoài ra tớnh khỏng cụn trựng truyền bệnh virus cũn phụ thuộc vào tuổi cõy trong từng loài,
ủối với nhúm khoai tõy dại S. brevidens cỏc lỏ non và lỏ trưởng thành rất ớt bị
rệp tấn cụng ngược lại lỏ non của S. etuberosum lại dễ bị tấn cụng hơn lỏ già nờn rất dễ bị nhiễm virus (Valkonen 1992a).
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 30
Cỏc nghiờn cứu xỏc ủịnh gen khỏng virus bằng chỉ thị phõn tử ủối với khoai tõy. Ye-Su Song và cộng sự (2005)[79] nghiờn cứu gen Ryadg là gen cú
tớnh khỏng PVY rất cao. Với 12 mồi của chỉ thị phõn tử AFLP sử dụng trờn 106 mẫu dũng khoai tõy cú nguồn gốc từ đức, Hà lan, Ba lan. Kết quả nghiờn cứu cho thấy cú 19 dũng ủược phỏt hiện bởi chỉ thị AFLP là khỏng PVY. Locus của gen Ryadg nằm ở trờn nhiễm sắc thể XII và cú thểủược phỏt hiện bởi chỉ thị SSR với mồi STM 003-111.
Gebhardt C., và cộng sự (2006)[56] ủó sử dụng chỉ thị phõn tử PCR với 4 mồi, dựng mồi RYSC, mồi RYSC3 ủể xỏc ủịnh gen Ryadg khỏng virus Y (PVY) khoai tõy, mồi CP60 ủể xỏc ủịnh gen Rxl khỏng virus X (PVX) khoai tõy, mồi Grol-4 ủể xỏc ủịnh gen khỏng bệnh G. sostchiensis kiểu Rol, mồi N125-1400 ủể
xỏc ủịnh gen khỏng bệnh u rễ (S.endobioticum kiểu 1, kiểu 2, kiểu 6). Cỏc dũng
ủược nghiờn cứu là Ry126, Ry62 chứa gen Ryadg; F1840/52, F1840/67 chứa gen
Rxl và gen Gro1 khỏng bệnh G.sostchiensis kiểu Ro1; P3 khụng chứa cả 2 gen
Ryadg, Rx1, chứa gen Sen1 khỏng S.endobioticum.
Bendahmane A., và cộng sự (1997)[46] nghiờn cứu gen Rx là gen khỏng mạnh với PVX. đối tượng nghiờn cứu là con lai F1 của giống tứ bội cara (Rx) với giống Huinkel (rx). Cỏc tỏc giảủó sử dụng chỉ thị phõn từ AFLP với cỏc mồi của khoai tõy và cà chua. Xỏc ủịnh ủược vị trớ của Rx ở phần cuối trờn nhiễm sắc thể XII, vị trớ này khỏc với vị trớ của Rx1 ủó ủược cỏc tỏc giả khỏc xỏc ủịnh trước
ủú. Marano M. R., và CS (2002)[64] cũng ủó nghiờn cứu gen Nb là một gen khỏng mạnh với PVX thuộc nhúm 1 và 2. Qua phõn tớch genome cho thấy Nb
nằm trờn nhiễm sắc thể số V và nằm cựng nhúm với nhiều gen khỏc. Trong nghiờn cứu của mỡnh, tỏc giảủó sử dụng 1300 cõy khoai tõy S1 từ cõy khoai tõy tứ bội cú nguồn gốc Pentland Ivory mang gen Nb, và dũng khoai tõy tứ bội cú nguồn gốc Cara mang gen Rxl lấy từ ngõn hàng gen BAC. Kết quả nghiờn cứu cho thấy là gen Nb nằm ở vị trớ 0.76 cM trờn nhiễm sắc thể và kẹp giữa 2 mồi
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 31
AFLP là GM339, GM637. Tỏc giả cũng phỏt hiện sự cú mặt của gen Rx1 bằng mồi dựng cho gen Nb, ủiều ủú chứng tỏ 2 gen Rxl và Nb nằm gần nhau.
2.7. Hướng nghiờn cứu tạo giống cú sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần cỏc thể nhị bội. cỏc thể nhị bội.
Theo phõn loại khoai tõy dựa vào số lượng NST, lấy số NST cơ bản là x=12 thỡ nhúm nhị bội thể (2n=2x=24NST) gồm bốn loài: S.Xajanhuiri, S.Goniocalyx, S.Phureja và S.Stenotonum. Theo nghiờn cứu của Hawkes (1978), phức hợp S.Cansense/ S.leptophyes cú quan hệ gần gũi nhất với cỏc loài khoai tõy nhị bội (diploid). Phức hợp S.phureja/ S.Stenotonum là dạng nguyờn thuỷ
nhất trong cỏc dạng nhị bội. Loài S.phureja cú khả năng tổ hợp với loài phụ
Tuberosum và cú xu hướng tạo giao tử khụng giảm nhiễm qua quỏ trỡnh giảm phõn khỏc thường.
Phương phỏp chọn tạo khoai tõy truyền thống nhờ kỹ thuật lai tạo, lai lại (back cross), ủột biết và chọn lọc (Kuckuck et al, 1985)[64] vấp phải những khú khăn về tớnh di truyền của kỹ thuật trồng trọt. Vỡ thế, ngay từ năm Chase S.S (1963)[52] ủó ủề nghị một sơ ủồ tạo giống khoai tõy, dựa trờn khả năng giảm mức bội thể xuống nhị bội. Cõy khoai tõy nhị bội (2n=2X=24 NST) cú thể thu
ủược qua kỹ thuật nuụi cấy bao phấn cỏc dũng tứ bội, Mix G, 1983[66]; Uhrig H, 1985[71]; Johansson, 1988[60]. Thể nhị bội này cũng cú thể thu ủược theo con ủường Parthenogenese (mẫu sinh) khi lai khoai tõy tứ bội với khoai tõy dại
Solanum phureja (Nitszche và Wenzel, 1977)[71]. Nhờ kỹ thuật nuụi cấy hạt phấn từ cỏc dũng ủơn bội (haploid) (1n=1x=12NST). Thể ủơn bội này sau khi nhõn ủụi nhiễm sắc thể sẽ trở thành thể nhị bội ủồng hợp tử. đú là vật liệu khởi
ủầu rất quan trọng cho việc tạo dũng chịu virus. Tuy nhiờn, khi trở lại dạng trồng trọt (tứ bội) bằng cỏch nhõn ủụi một cỏch ủơn giản cỏc thể nhị bội này sẽ
làm giảm ủộ heterozygote, dẫn ủến giảm sức sống và giảm năng suất của cõy tứ
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 32 Dũng tetraploid a*1a2a3a4 a*1a2a3a4 a*1a2a3a4 a*1a2a3a4
Tạo cõy dihaploid
Chọn lọc a*1a a*2a a*3a a*4a Tạo cõy monohaploid + xử lý ủa bội tạo cõy 2x
Chọn lọc a*1a*1 x a*2a*2 a*3a*3 x a*4a*4
a*1a*2 dung hợp a*3a*4
Dũng tetraploid mới a*1a*2a*3a*4
Sơ ủồ tạo giống khoai tõy của Wenzel, 1979.
để khắc phục những hiện tượng trờn, Wenzel et al 1979 [80] ủó ủưa ra sơ ủồ tạo giống tổng hợp phõn tớch dưới ủõy:
a. Bộ gen monohaploid của khoai tõy *. Tớnh trạng mong muốn.
Sơ ủồ cho thấy sự ỏp dụng tổ hợp cỏc kỹ thuật của cụng nghệ tế bào trong tạo giống khoai tõy bao gồm cỏc kỹ thuật: giảm ủộ bội từ tứ bội xuống ủơn bội, sau
ủú chọn lọc thể nhị bội và cuối cựng dung hợp tế bào trần hai thể nhị bội ủó chọn lọc ủể tạo giống khoai tõy tứ bội mang cỏc ủặc tớnh mong muốn.
Tế bào trần là tế bào thực vật bị tỏch bỏ thành tế bào, chỉ cũn phần nguyờn sinh chất, nhõn, cỏc cơ quan tử khỏc và màng sinh chất là ranh giới phõn biệt bờn trong và bờn ngoài tế bào trần.
Haberlandt (1902), lần ủầu tiờn ủó quan niệm rằng: Mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật ủa bào ủều cú khả năng tiềm tàng ủể phỏt triển thành một cỏ thể hoàn chỉnh.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 33
Tuy nhiờn phải chờ ủến những năm cuối của thập kỷ 60 mới cú những kết quả về sự tỏi sinh thành cụng cỏc cõy hoàn chỉnh từ cỏc tế bào tỏch rời, một phỏt triển vượt bậc của kỹ thuật nuụi cấy thực vật in vitro. Cocking (1960) nuụi cấy thành cụng tế bào trần cõy cà chua. Takabe và cộng sự (1971) tỏi sinh ủược cõy thuốc lỏ hoàn chỉnh từ Protoplast. Melchers (1977) dung hợp protoplast thành cụng giữa khoai tõy và cà chua.
Khi hai hay nhiều tế bào trần dung hợp với nhau chỳng sẽ tạo thành một. Quỏ trỡnh ủú gọi là dung hợp tế bào trần hay dung hợp protoplast.
Dung hợp tế bào trần bao gồm ba pha:
1. Pha kết ủớnh: Màng sinh chất của hai hay nhiều tế bào trấn tiến sỏt nhau. 2. Dung hợp màng tại những vựng nhỏ liờn kết chặt dẫn ủến hỡnh thành tế
bào chất liờn tục hoặc cầu giữa cỏc tế bào trần.
3. Gión nở của cỏc cầu nối nguyờn sinh chất và hỡnh thành thểủồng nhõn hoặc dị nhõn.
Nếu tế bào trần cú cựng nguồn gốc từ cỏc tế bào soma (tế bào sinh dưỡng) thuộc cỏc giống, loài, hoặc chi khỏc nhau dung hợp với nhau thỡ ta gọi hiện tượng ủú là dung hợp soma hay lai tế bào soma.
Sự ra ủời của kỹ thuật dung hợp Protoplast cho phộp tạo ra những tỏi tổ
hợp di truyền giữa cỏc ủơn vị phõn loại xa (loài hay chi) mà bằng phương phỏp lai hữu tớnh khú hoặc khụng thể ủạt ủược. Trong quỏ trỡnh dung hợp cỏc genom trong nhõn cũn cú thể xảy ra sự hợp nhất tế bào chất giữa cỏc protoplast. Nhờ
vậy, một số tớnh trạng do cỏc gen trong tế bào chất kiểm soỏt như tớnh bất dục
ủực cú thể chuyển một cỏch khụng khú khăn từ cõy này sang cõy khỏc.
Cõy khoai tõy ủầu tiờn tỏi sinh thành cụng từ tế bào trần với cụng trỡnh của Shepard, Totten 1977[74]. Tiếp ủú, việc nghiờn cứu nuụi cấy và tỏi sinh tế
bào trần khoai tõy ủược rất nhiều tỏc giả quan tõm (Binding và Nehls, 1977[48], Bokelmann và Roest 1983[49], Haberlach et al 1985[59]. Theo hướng giỏo sư
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 34
cũng dần tăng lờn. Cụng trỡnh nổi tiếng của Melchers et al 1974[65] về lai soma giữa khoai tõy Tuberosum và cà chua Lycopersicum esculentum là một mở ủầu của hàng loạt cỏc nghiờn cứu về dung hợp giữa cỏc loài khoai tõy hoang dại với cà chua trồng trọt vốn khụng thể tiến hành bằng con ủường hữu tớnh. Butenko và Kuchko (1980)[43] ủó tiến hành dung hợp tế bào trần Solanum tuberosum với
Solanum nirgum và Puite et al (1986)[65] dung hợp với Solanum brevidens như
một ỘpartnerỢ dung hợp vỡ giống này chống chịu rất tốt với virus cuốn lỏ (PLRV). Cỏc tổ chức dung hợp tế bào trần giữa cỏc giống khoai tõy nhị bội cú triển vọng ở phỏp như BF15, Aminca, Cardinal ủó ủược Chaput, Darasing Sihachakr et al, (1990)[51] tiến hành. Cũng cú những cụng bố rất gần ủõy về
dung hợp tế bào trần giữa giống khoai tõy BF15 với khoai tõy dại Solanum berthaultii ủể tạo giống khoai tõy chống rệp truyền bệnh virus. Kết quả cho thấy
ủặc tớnh nhiều lụng trờn mặt lỏ, ngăn cản sự chớch hỳt của rệp ở Solanum berthaultii
ủó ủược chuyển nạp cho con lai soma (Sereaf, Darasinh Sihachakr, DucreuxẦ1991)[73]. Cú thể núi những cụng trỡnh của Deimling (1989)[55], là những cụng trỡnh khỏ toàn diện về ứng dụng kỹ thuật ứng dụng rộng rói của phương phỏp này tiếp cận nhất với thực tiễn.
Năm 1993, tỏc giả Nguyễn Quang Thạch (1993) [28] ủó sử dụng 39 giống nhị bội trong tập ủoàn khoai tõy của viện nghiờn cứu di truyền Grundbach ủể
thanh lọc ra cỏc giống chống chịu virus PVX và PVY và ủó thanh lọc ra 13 giống khoai tõy nhị bội cú tớnh chất chống chịu khỏc nhau ủể ủưa vào tỏch và dung hợp tế bào trần. Kết quả thu ủược cỏc cõy lai soma cú khả năng sinh trưởng và phỏt triển mạnh hơn so với bố mẹ, nhiều ủặc trưng hỡnh thỏi thể hiện dạng trung gian.
Dung hợp thể nhị bội cú thể ủược sử dụng ủể tổ hợp 2 giống khoai tõy