3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.3. Phương phỏp nghiờn cứu
3.3.1. ðỏnh giỏ sự sinh trưởng phỏt triển, hệ số nhõn và tạo củ của cỏc dũng khoai tõy nhị bội trong ủiều kiện in vitro.
- Cỏc dũng khoai tõy diploid ủược ủưa vào nuụi cấy in vitro. Mụi trường nuụi cấy là mụi trường MS
- Cõy in vitro ủược ủặt trong phũng nuụi theo chếủộ nhiệt ủộ là 220C, cường ủộ
chiếu sỏng là 3000-4000 lux, quang chu kỳ là 16h chiếu sỏng/ngày
- Tiến hành theo dừi ủộng thỏi tăng trưởng chiều cao và số lỏ, chỉ tiờu theo dừi trong 5 tuần ủầu, 7 ngày/lần
Chỉ tiờu theo dừi:
+ Chiều cao: tớnh từ bề mặt của mụi trường tới ủỉnh sinh trưởng của cõy (cm) + Số lỏ: Tớnh từ cỏc lỏ xuất hiện ủầu tiờn từủốt thõn cõy cho tới lỏ ngọn (lỏ) + Hệ số nhõn (lần/thỏng): Tổng số cõy thu ủược/ tổng số cõy ban ủầu
- Thớ nghiệm tạo củ in vitro ủược tiến hành như sau: Cỏc bỡnh cõy ủược nhõn lờn trong mụi trường cơ bản MS, sau khoảng 5 tuần nuụi cõy ủạt khoảng 7-12 cm thỡ
ủổủường, với nồng ủộ 120 g/l mụi trường. Cỏc bỡnh mẫu ủó ủổủường ủược giữ
trong ủiều kiện tối hoàn toàn, sau khoảng 50-60 ngày thu củ. Cỏc chỉ tiờu theo dừi:
+ Số củ trung bỡnh trờn mỗi cõy. ðược xỏc ủịnh bằng phương phỏp ủếm thụng thương số củ trong mỗi bỡnh rồi chia cho tổng số cõy trong bỡnh.
+ Khối lượng trung bỡnh củ (g/củ) = Tổng khối lượng củ/ Tổng số củ thu hoạch
3.3.2 ðỏnh giỏ ủặc ủiểm hỡnh thỏi, sự sinh trưởng phỏt triển và hỡnh thành
năng suất của cỏc dũng khoai tõy nhị bội ngoài ủồng ruộng
- Thời vụ: Vụủụng xuõn
- Cỏc dũng khoai tõy ủược trồng trong chậu, mỗi dũng 30 cõy, sử dụng giỏ thể là sơ dừa + ủất sạch ( tỉ lệ 1:1)
- Trồng vào ngày 11/1/2009 và thu hoạch vào ngày 5/4/2010 tại nhà lưới Viện Sinh học Nụng Nghiệp – Trường ðại học Nụng Nghiệp I.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 41
-Cỏc chỉ tiờu theo dừi 15 ngày 1 lần:
+ Chiều cao cõy (cm): ðo trực tiếp từ gốc ủến ủỉnh sinh trưởng. + Số lỏ trờn cõy (lỏ): Tổng số lỏ cú trờn cõy tại thời ủiểm theo dừi. + ðặc ủiểm thõn: Hỡnh dạng, màu sắc, kớch thước.
+ ðặc ủiểm lỏ: Màu sắc, hỡnh dạng, kớch thước, số thuỳ trờn lỏ, số tai lỏ trờn lỏ. + ðặc ủiểm củ: Hỡnh dạng củ, kớch thước, số mắt trờn củ, ủộ sõu mắt củ, màu sắc vỏ củ, màu sắc ruột củ, màu sắc mắt củ.
+ Chỉ số diện tớch lỏ (LAI): ðo bằng phương phỏp cõn.
Diện tớch lỏ ủo bằng cỏch lấy 1dm² giấy cõn ủược khối lượng P1. In toàn bộ số lỏ lờn giấy (giấy phải ủồng nhất), cắt phần giấy cú hỡnh của lỏ sau ủú ủem cõn ủược khối lượng P2. Diện tớch lỏ S = P2/P1 (dm²).
LAI = Tổng diện tớch lỏ (m²)/ Tổng diện tớch ủất (m²)
Chỉ tiờu diện tớch lỏ ủược ủo vào 3 thời ủiểm: 45 ngày, 60 ngày sau khi trồng và khi cõy ngừng sinh trưởng.
+ Cỏc chỉ tiờu năng suất:
+ Khối lượng trung bỡnh củ (g/củ) = Tổng khối lượng củ/ Tổng số củ thu hoạch + Năng suất thực thu : Là số kg củ thu ủược trờn một ủơn vị diện tớch thớ nghiệm.
+ Năng suất lý thuyết (kg/ha) = Khối lượng củ/khúm (kg) x Số khúm/m² x 10000
3.3.3. ðỏnh giỏ khả năng khỏng bệnh mốc sương khoai tõy Phytophthora
infestans của cỏc dũng khoai tõy nhị bội
*Phương phỏp thu thập mẫu nấm bệnh, phõn lập mẫu bệnh, ủiều chế mụi
trường
+ Phương phỏp thu thập mẫu nấm bệnh (Theo bộ mụn bệnh cõy- Trường ðại Học Nụng Nghiệp Hà Nội)
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 42
Mẫu bệnh ủược thu thập tại cỏc ủiểm ủiều tra, lấy mẫu theo phương phỏp ngẫu nhiờn.
Mẫu lỏ bệnh ủược thu thập ở cỏc lỏ bỏnh tẻ, khụng dớnh thuốc bảo vệ thực vật. Cỏc mẫu lỏ sau khi thu thập ghi ủịa ủiểm ủiều tra, cõy kớ chủ, nếu cú thể tỡm hiểu thờm về giống, chếủộ chăm súc. Mẫu bệnh ủược bảo quản trong thựng xốp cú lút ủỏ khụ ủể bảo ủảm nhiệt ủộ thấp, khụng ủể lỏ bệnh sỏt với tỳi ủỏ khụ, khụng ủể mẫu bệnh bị núng vỡ khi núng lỏ rất nhanh mủn nỏt và xuất hiện nhiều vi khuẩn hoại sinh.
Lỏ bệnh sau khi thu thập về phũng thớ nghiệm ủược ủặt trong mụi trường
ẩm bóo hoà (thường là trong hộp petri cú lút giấy lọc ẩm) trong vũng 12-24 tiếng
ở ủiều kiện tối thớch 16-180C.
+ Phương phỏp phõn lập mẫu bệnh (Caten và Jinks, 1968).
Chuẩn bị mẫu bệnh : cỏc mẫu bệnh thu ngoài ủồng ruộng chọn những mẫu ủiển hỡnh, mới, cũn tươi, khụng dớnh thuốc bảo vệ thực vật phõn lập ngay hoặc cú thể ủặt trong mụi trường ẩm bóo hoà với ủiều kiện nhiệt ủộ 16-180C trong vũng từ 12-24 tiếng ủể mụ bệnh hồi phục và cành bào tử phõn sinh và bào tử phõn sinh phỏt triển thành 1 lớp trắng xốp. Lỳc này cú thể kiểm tra xem cú
ủỳng là cành bào tử và bào tử phõn sinh của P. infestans hay khụng. Chuẩn bị cỏc vật liệu dựng trong phõn lập :
- Nếu phõn lập bằng khoai tõy. Củ, lỏ khoai tõy sạch thuộc cỏc giống nhiễm bệnh như Diamant ủược thu từ cõy trồng trong nhà lưới hoặc cỏc củ
khoai tõy thương phẩm sạch bệnh và khụng sử dụng cỏc loại thuốc nội hấp chống bệnh mốc sương. Củ ủược rửa sạch ủất trờn bề mặt bằng nước mỏy, ủể
rỏo. Khử trựng bề mặt củ bằng Sodium hypochloride 1% trong 3 phỳt hoặc nhỳng vào cồn 700 sau ủú ủốt trờn ngọn lửa ủốn cồn, chỳ ý khi ủốt ủảo ủều trỏnh củ bị quỏ núng gõy chết mụ. Cỏc củ sau ủú ủược cắt thành cỏc lỏt cú kớch thước 5-7mm.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 43
- Nếu phõn lập bằng quả cà chua. Quả, lỏ cà chua xanh, sạch bệnh thuộc cỏc giống mẫn cảm như HT7, HT9 ủược thu từ những cõy sạch bệnh trồng trong nhà lưới, hoặc cõy sạch bệnh trờn ruộng sản xuất khụng phun cỏc loại thuốc nội hấp cũng như tiếp xỳc ủể trừ bệnh mốc sương. Rửa sạch quả bằng nước mỏy, ủể rỏo, khử trựng quả bằng Sodium hypochloride 1% trong 3 phỳt,
ủể rỏo. Cắt ngang quả thành những lỏt từ 5-7mm.
Phõn lập : cỏc mụ bệnh ủược cắt thành cỏc miếng nhỏ kớch thước khoảng 1cm2 chứa ẵ mụ bệnh ẵ mụ khoẻ, nếu mụ bệnh bị hoại sinh quỏ nhiều cú thể
lấy miếng to hơn nhưng khả năng tạp nhiễm nấm hoại sinh khỏc sẽ cao hơn. Cỏc mảnh mụ ủược khử trựng nhanh qua Sodium hypochloride 1% trong 3 phỳt hoặc bằng cồn 700 trong 1 phỳt, mảnh mụ sau ủú ủược nhỳng qua nước cất vụ trựng, ủể khụ hoặc thấm nước bằng giấy thấm sạch.
Cỏc mảnh mụ bệnh sau ủú ủược ủặt ỳp xuống sau ủú ủặt một lỏt cà chua hoặc khoai tõy ủó ủược chuẩn bị như bước trờn ủậy nắp hộp petri. Chỳ ý khụng
ủể lỏt khoai tõy hoặc cà chua bị quỏ khụ bề mặt vỡ cú thể sẽ tạo ra lớp màng tế
bào chết làm cho nấm khụng xõm nhập ủược. Cỏc ủĩa phõn lập ủược ủặt trong
ủiều kiện 180C trong ủiều kiện tối hoàn toàn. Thường xuyờn kiểm tra sự hỡnh thành sợi nấm, cành bào tử phõn sinh và bào tử phõn sinh ở mặt trờn lỏt cắt khoai tõy hay cà chua. Kiểm tra dưới kớnh lỳp soi nổi, nếu ủỳng là sợi hoặc cành bào tử phõn sinh, bào tử phõn sinh của nấm mốc sương thỡ dựng que cấy khờu nhẹ sợi nấm hoặc cành bào tử phõn sinh ủặt lờn mụi trường Pea-agar. Tuỳ
thuộc vào giống khoai tõy và cà chua mà thời gian xuất hiện sợi nấm, cành bào tử phõn sinh và bào tử phõn sinh nhanh hay chậm, nếu thấy dấu hiện vựng ủặt mụ bệnh thõm ủen thỡ cú thể kết luận nấm ủó xõm nhập vào mụ thực vật.
Sau khi chuyển nấm trờn mụi trường 3-4 ngày kiểm tra sợi nấm cú phỏt triển hay khụng, và nấm ủó thuần hay chưa. Nếu mẫu ủó thuần cú thể cấy chuyển sau 7-9 ngày trờn mụi trường Pea (mụi trường phỏt triển hệ sợi và bào tử vụ tớnh) hoặc mụi trường Rye ủể thực hiện cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 44
+ Phương phỏp ủiều chế mụi trường.
- Mụi trường Pea-agar(Corbiere R. Andrivon D., 2000) Cụng thức nấu cho 1 lit mụi trường.
Thành phần bao gồm:
+ ðậu Hà Lan : 125g + Agar: 15g
+ Nước cất: 1200ml
Cỏch ủiều chế mụi trường: Cho 125g ủậu + 1,2l nước cất vào nồi sạch.
ðun sụi, sau ủú nhỏ lửa trong vũng 45phỳt, lọc bằng vải lọc 4 lớp. Sau ủú cho vào bỡnh ủịnh mức 1l. Hoà tan 15g agar vào bỡnh và hấp khử trựng ở 121°C, 1.5 atm trong 30 phỳt. Sau ủú ủể nguội mụi trường ủến 60 - 70°C rồi ủem ủổ ra cỏc
ủĩa peptri ủó ủược khử trựng và sử dụng ủể cấy nấm.
* Phương phỏp nhõn nuụi nấm tạo bào tử phõn sinh: Nhõn nuụi nấm tạo bào tử
phõn sinh nhằm mục ủớch tạo ra một số lượng lớn bào tử ủể lõy nhiễm nhõn tạo, nhõn nuụi nấm tạo bào tử phõn sinh bằng cỏch sau:
Nhõn trờn lỏ khoai tõy: lỏ khoai tõy thuộc cỏc giống mẫn cảm sạch bệnh trồng trong nhà lưới cỏch ly. Cỏc lỏ ủơn sạch khụng bỏm ủất, khụng quỏ già, ỳa
ủược ủặt ỳp mặt trờn xuống trong cỏc khay cú lút giấy thấm ủó thấm nước cú thể
phun trực tiếp dung dịch nước cú chứa bào tử lờn mặt dưới lỏ hoặc nhỏ cỏc giọt bào tử lờn mặt dưới lỏ. Bọc cỏc khay lại ủể ủảm bảo ẩm ủộ thớch hợp ủể trong
ủiều kiện 12 giờ sỏng 12 giờ tối.
* Phương phỏp thu bào tử:
Thu bào tử nhõn trờn lỏ khoai tõy: lỏ ủó nhiễm bệnh ủược bỏ vào tỳi nilon cựng với 10-20ml nước cất vụ trựng tựy thuộc theo kớch thước lỏ lắc ủều, nếu lỏ cũn nguyờn nhặt lỏ bỏ ra ngoài chắt nước vào bỡnh hay cốc ủong, nếu lỏ bị nỏt cú thể lọc qua vải màn ủể trỏnh cỏc mụ tế bào làm tắc bỡnh phun hoặc làm sai lệch thể tớch.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 45
*Phương phỏp ủỏnh tớnh khỏng nhiễm trờn cõy in vitro khoai tõy ủối với nấm P. infestans. (Theo trung tõm cõy cú củ)
- Pha dung dịch bào tửủó nhõn nuụi ở nồng ủộ 104 bào tử/ml lõy nhiễm bằng cỏch dựng bỡnh phun dung dịch bào tử vào bỡnh cõy in vitro .
- Sau ủú ủặt trong tủ ủịnh ụn ở ủiều kiện 12h sỏng/tối và 180C. Quan sỏt sự hỡnh thành bào tử, cành bào tử và sợi nấm.
- Chỉ tiờu ủỏnh giỏ : Dựa vào mức ủộ bị hại của tỏn lỏ.
A TLB(%) = 100 Bì A: Số lỏ bị bệnh B. Tổng số lỏ lõy nhiễm Thang ủiểm ủỏnh giỏ: Thang ủiểm Phần trăm lỏ bị hại (%) Mức ủỏnh giỏ 1 0 Khỏng cao 2 1-10 Khỏng 3 11-20 Nhiễm nhẹ 4 21-30 Nhiễm vừa 5 31-40 Nhiễm vừa 6 41-50 Nhiễm nặng 7 51-60 Nhiễm nặng 8 61-70 Nhiễm nặng 9 > 70 Nhiễm nặng
* Phương phỏp ủỏnh giỏ tớnh khỏng nhiễm trờn củ khoai tõy ủối với nấm P. infestans. (Theo bộ mụn bệnh cõy- Trường ðại Học Nụng Nghiệp Hà Nội) - Tớnh khỏng nhiễm toàn củ
Tiến hành lõy nhiễm cỏc củ khoai tõy thuộc 6 dũng (Pt771, Pt772, Pt773, Ratte, Pnt 2G, Atlantic) với 3 lần lặp lại, mỗi lần 20 củ, tiến hành lõy nhiễm với
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 46
mức 50000 bào tửủộng/ml giữủộẩm cao trong vũng 7 ngày cắt củ quan sỏt tớnh khỏng nhiễm của củ.
- Tớnh khỏng nhiễm trờn khoanh củ
Củ khoai tõy ủược làm sạch cắt khoanh dày 5-7mm lõy nhiễm 10àl dịch bào tử nồng ủộ 50000 bào tử ủộng/ml với 3 lần lặp lại, mỗi lần 30 lỏt củ sau 7 ngày quan sỏt tớnh khỏng nhiễm trờn khoanh củ.
3.3.4. ðỏnh giỏ khả năng khỏng virus của cỏc dũng khoai tõy nhị bội qua chỉ thị phõn tử
ADN tổng số của 6 dũng khoai tõy nhị bội sau khi tỏch chiết và tinh sạch sẽ ủược tiến hành phản ứng PCR, sử dụng cỏc mồi ủặc hiệu cho phộp nhõn lờn
ủoạn cú liờn kết chặt với cỏc gen khỏng virus. Từ ủú ủề xuất cỏc tổ hợp lai và cỏc mồi chọn lọc con lai sau dung hợp.
- Sử dụng phương phỏp tỏch chiết và tinh sạch ADN tổng số của GS. Hans – Joerg Jacobsen trường ðại học Hannover (phụ lục 4).
- ðiện di ADN tổng số và sản phẩm PCR:
ADN tổng số ủược kiểm tra ủộ nguyờn vẹn trờn gel agarose 1%. Sản phẩm PCR ủược kiểm tra trờn gel agarose 3%.
Bản gel sau khi chạy ủược nhuộm bằng Ethidium bromide và ủược chụp hiện hỡnh bằng tia UV.
3.4. Phương phỏp sử lý số liệu
Cỏc chỉ tiờu ủo ủếm ủược xử lý kết quả trờn phần mềm Microsoft office Excel.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 47
4. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. ðỏnh giỏ sự sinh trưởng phỏt triển, hệ số nhõn và tạo củ in vitro của cỏc dũng khoai tõy nhị bội.
ðể gúp phần vào việc chọn lọc và lai tạo những dũng khoai tõy cú năng suất cao, phẩm chất tốt bằng kỹ thuật dung hợp tế bào trần thỡ việc khảo sỏt ủỏnh giỏ khả năng sinh trưởng của cỏc dũng khoai tõy nhị bội trong ủiều kiện in vitro là rất cần thiết. Cỏc dũng khoai tõy diploid ủược ủưa vào nuụi cấy in vitro. Mụi trường nuụi cấy là mụi trường MS. Cõy in vitro ủược ủặt trong phũng nuụi theo chếủộ nhiệt ủộ là 220C, cường ủộ chiếu sỏng là 3000-4000 lux, quang chu kỳ là 16h chiếu sỏng/ngày. Cỏc chỉ tiờu theo dừi ủịnh kỳ 7 ngày 1 lần.
4.1.1. ðộng thỏi sinh trưởng chiều cao và số lỏ.
Bảng 4.1: ðộng thỏi sinh trưởng chiều cao của cỏc dũng khoai tõy nhị bội
( ðơn vị: cm)
Dũng khoai tõy theo dừi T.gian Atlantic Pt771 Pt772 Pt773 Ratte Pnt2G Trn3G Tuần1 3,5 3,7 2,2 3,4 3,7 3,9 3,4 Tuần2 6,3 5,9 4,3 5,1 5,7 6 5,5 Tuần3 8,4 7,9 5,2 5,9 7,2 7,8 8,9 Tuần4 9,7 8,7 6,0 6,8 7,925 8,6 9,8 Tuần5 11,5 9,5 7,2 7,8 9,0 10,2 10,6 Qua bảng và ủồ thị 4.1 cho thấy:
- Cỏc dũng khoai tõy nhị bội ủều sinh trưởng tốt, tuy nhiờn tốc ủộ tăng trưởng chậm hơn so với ủối chứng tứ bội Atlantic. Tốc ủộ sinh trưởng chiều cao của cỏc dũng khỏc nhau.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 48
- Dũng Pnt 2G, Trn 3G cú tốc ủộ tăng trưởng chiều cao nhanh và mạnh nhất, dũng Trn 3G ủạt chiều cao sau 5 tuần theo dừi 10,6cm, dũng Pnt 2G ủạt 10,2 cm. Dũng Pt772 cú tốc ủộ tăng trưởng chậm nhất chiều cao cuối cựng chỉủạt 7,2 cm.
0 2 4 6 8 10 12 14 Tuần1 Tuần2 Tuần3 Tuần4 Tuần5
Thời gian theo dừi
c h i ề u c a o c õ y Atlantic Pt771 Pt772 Pt773 Ratte Pnt2G Trn3G
ðồ thị 4.1: ðộng thỏi sinh trưởng chiều cao của cỏc dũng khoai tõy nhị bội
Bảng 4.2: ðộng thỏi tăng trưởng số lỏ của cỏc dũng khoai tõy nhị bội
( ðơn vị: lỏ)
Dũng khoai tõy theo dừi