2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.7. Hướng nghiờn cứu tạo giống cú sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần cỏc
cỏc thể nhị bội.
Theo phõn loại khoai tõy dựa vào số lượng NST, lấy số NST cơ bản là x=12 thỡ nhúm nhị bội thể (2n=2x=24NST) gồm bốn loài: S.Xajanhuiri, S.Goniocalyx, S.Phureja và S.Stenotonum. Theo nghiờn cứu của Hawkes (1978), phức hợp S.Cansense/ S.leptophyes cú quan hệ gần gũi nhất với cỏc loài khoai tõy nhị bội (diploid). Phức hợp S.phureja/ S.Stenotonum là dạng nguyờn thuỷ
nhất trong cỏc dạng nhị bội. Loài S.phureja cú khả năng tổ hợp với loài phụ
Tuberosum và cú xu hướng tạo giao tử khụng giảm nhiễm qua quỏ trỡnh giảm phõn khỏc thường.
Phương phỏp chọn tạo khoai tõy truyền thống nhờ kỹ thuật lai tạo, lai lại (back cross), ủột biết và chọn lọc (Kuckuck et al, 1985)[64] vấp phải những khú khăn về tớnh di truyền của kỹ thuật trồng trọt. Vỡ thế, ngay từ năm Chase S.S (1963)[52] ủó ủề nghị một sơ ủồ tạo giống khoai tõy, dựa trờn khả năng giảm mức bội thể xuống nhị bội. Cõy khoai tõy nhị bội (2n=2X=24 NST) cú thể thu
ủược qua kỹ thuật nuụi cấy bao phấn cỏc dũng tứ bội, Mix G, 1983[66]; Uhrig H, 1985[71]; Johansson, 1988[60]. Thể nhị bội này cũng cú thể thu ủược theo con ủường Parthenogenese (mẫu sinh) khi lai khoai tõy tứ bội với khoai tõy dại
Solanum phureja (Nitszche và Wenzel, 1977)[71]. Nhờ kỹ thuật nuụi cấy hạt phấn từ cỏc dũng ủơn bội (haploid) (1n=1x=12NST). Thể ủơn bội này sau khi nhõn ủụi nhiễm sắc thể sẽ trở thành thể nhị bội ủồng hợp tử. đú là vật liệu khởi
ủầu rất quan trọng cho việc tạo dũng chịu virus. Tuy nhiờn, khi trở lại dạng trồng trọt (tứ bội) bằng cỏch nhõn ủụi một cỏch ủơn giản cỏc thể nhị bội này sẽ
làm giảm ủộ heterozygote, dẫn ủến giảm sức sống và giảm năng suất của cõy tứ
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 32 Dũng tetraploid a*1a2a3a4 a*1a2a3a4 a*1a2a3a4 a*1a2a3a4
Tạo cõy dihaploid
Chọn lọc a*1a a*2a a*3a a*4a Tạo cõy monohaploid + xử lý ủa bội tạo cõy 2x
Chọn lọc a*1a*1 x a*2a*2 a*3a*3 x a*4a*4
a*1a*2 dung hợp a*3a*4
Dũng tetraploid mới a*1a*2a*3a*4
Sơ ủồ tạo giống khoai tõy của Wenzel, 1979.
để khắc phục những hiện tượng trờn, Wenzel et al 1979 [80] ủó ủưa ra sơ ủồ tạo giống tổng hợp phõn tớch dưới ủõy:
a. Bộ gen monohaploid của khoai tõy *. Tớnh trạng mong muốn.
Sơ ủồ cho thấy sự ỏp dụng tổ hợp cỏc kỹ thuật của cụng nghệ tế bào trong tạo giống khoai tõy bao gồm cỏc kỹ thuật: giảm ủộ bội từ tứ bội xuống ủơn bội, sau
ủú chọn lọc thể nhị bội và cuối cựng dung hợp tế bào trần hai thể nhị bội ủó chọn lọc ủể tạo giống khoai tõy tứ bội mang cỏc ủặc tớnh mong muốn.
Tế bào trần là tế bào thực vật bị tỏch bỏ thành tế bào, chỉ cũn phần nguyờn sinh chất, nhõn, cỏc cơ quan tử khỏc và màng sinh chất là ranh giới phõn biệt bờn trong và bờn ngoài tế bào trần.
Haberlandt (1902), lần ủầu tiờn ủó quan niệm rằng: Mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật ủa bào ủều cú khả năng tiềm tàng ủể phỏt triển thành một cỏ thể hoàn chỉnh.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 33
Tuy nhiờn phải chờ ủến những năm cuối của thập kỷ 60 mới cú những kết quả về sự tỏi sinh thành cụng cỏc cõy hoàn chỉnh từ cỏc tế bào tỏch rời, một phỏt triển vượt bậc của kỹ thuật nuụi cấy thực vật in vitro. Cocking (1960) nuụi cấy thành cụng tế bào trần cõy cà chua. Takabe và cộng sự (1971) tỏi sinh ủược cõy thuốc lỏ hoàn chỉnh từ Protoplast. Melchers (1977) dung hợp protoplast thành cụng giữa khoai tõy và cà chua.
Khi hai hay nhiều tế bào trần dung hợp với nhau chỳng sẽ tạo thành một. Quỏ trỡnh ủú gọi là dung hợp tế bào trần hay dung hợp protoplast.
Dung hợp tế bào trần bao gồm ba pha:
1. Pha kết ủớnh: Màng sinh chất của hai hay nhiều tế bào trấn tiến sỏt nhau. 2. Dung hợp màng tại những vựng nhỏ liờn kết chặt dẫn ủến hỡnh thành tế
bào chất liờn tục hoặc cầu giữa cỏc tế bào trần.
3. Gión nở của cỏc cầu nối nguyờn sinh chất và hỡnh thành thểủồng nhõn hoặc dị nhõn.
Nếu tế bào trần cú cựng nguồn gốc từ cỏc tế bào soma (tế bào sinh dưỡng) thuộc cỏc giống, loài, hoặc chi khỏc nhau dung hợp với nhau thỡ ta gọi hiện tượng ủú là dung hợp soma hay lai tế bào soma.
Sự ra ủời của kỹ thuật dung hợp Protoplast cho phộp tạo ra những tỏi tổ
hợp di truyền giữa cỏc ủơn vị phõn loại xa (loài hay chi) mà bằng phương phỏp lai hữu tớnh khú hoặc khụng thể ủạt ủược. Trong quỏ trỡnh dung hợp cỏc genom trong nhõn cũn cú thể xảy ra sự hợp nhất tế bào chất giữa cỏc protoplast. Nhờ
vậy, một số tớnh trạng do cỏc gen trong tế bào chất kiểm soỏt như tớnh bất dục
ủực cú thể chuyển một cỏch khụng khú khăn từ cõy này sang cõy khỏc.
Cõy khoai tõy ủầu tiờn tỏi sinh thành cụng từ tế bào trần với cụng trỡnh của Shepard, Totten 1977[74]. Tiếp ủú, việc nghiờn cứu nuụi cấy và tỏi sinh tế
bào trần khoai tõy ủược rất nhiều tỏc giả quan tõm (Binding và Nehls, 1977[48], Bokelmann và Roest 1983[49], Haberlach et al 1985[59]. Theo hướng giỏo sư
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 34
cũng dần tăng lờn. Cụng trỡnh nổi tiếng của Melchers et al 1974[65] về lai soma giữa khoai tõy Tuberosum và cà chua Lycopersicum esculentum là một mở ủầu của hàng loạt cỏc nghiờn cứu về dung hợp giữa cỏc loài khoai tõy hoang dại với cà chua trồng trọt vốn khụng thể tiến hành bằng con ủường hữu tớnh. Butenko và Kuchko (1980)[43] ủó tiến hành dung hợp tế bào trần Solanum tuberosum với
Solanum nirgum và Puite et al (1986)[65] dung hợp với Solanum brevidens như
một ỘpartnerỢ dung hợp vỡ giống này chống chịu rất tốt với virus cuốn lỏ (PLRV). Cỏc tổ chức dung hợp tế bào trần giữa cỏc giống khoai tõy nhị bội cú triển vọng ở phỏp như BF15, Aminca, Cardinal ủó ủược Chaput, Darasing Sihachakr et al, (1990)[51] tiến hành. Cũng cú những cụng bố rất gần ủõy về
dung hợp tế bào trần giữa giống khoai tõy BF15 với khoai tõy dại Solanum berthaultii ủể tạo giống khoai tõy chống rệp truyền bệnh virus. Kết quả cho thấy
ủặc tớnh nhiều lụng trờn mặt lỏ, ngăn cản sự chớch hỳt của rệp ở Solanum berthaultii
ủó ủược chuyển nạp cho con lai soma (Sereaf, Darasinh Sihachakr, DucreuxẦ1991)[73]. Cú thể núi những cụng trỡnh của Deimling (1989)[55], là những cụng trỡnh khỏ toàn diện về ứng dụng kỹ thuật ứng dụng rộng rói của phương phỏp này tiếp cận nhất với thực tiễn.
Năm 1993, tỏc giả Nguyễn Quang Thạch (1993) [28] ủó sử dụng 39 giống nhị bội trong tập ủoàn khoai tõy của viện nghiờn cứu di truyền Grundbach ủể
thanh lọc ra cỏc giống chống chịu virus PVX và PVY và ủó thanh lọc ra 13 giống khoai tõy nhị bội cú tớnh chất chống chịu khỏc nhau ủể ủưa vào tỏch và dung hợp tế bào trần. Kết quả thu ủược cỏc cõy lai soma cú khả năng sinh trưởng và phỏt triển mạnh hơn so với bố mẹ, nhiều ủặc trưng hỡnh thỏi thể hiện dạng trung gian.
Dung hợp thể nhị bội cú thể ủược sử dụng ủể tổ hợp 2 giống khoai tõy diplod, cỏc tớnh trạng nụng sinh học cú thể ủược bổ sung lẫn nhau trong quỏ trỡnh dung hợp, trong khi phương phỏp lai truyền thống phải thụng qua con
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 35
Dung hợp hai dũng khoai tõy diploid cú tớnh trạng tốt theo lý thuyết chỉ
cần qua một bước cú thể tạo ra những giống tứ bội cú ủộ dị hợp cao. Ưu thế lai cú thể ủược tạo ra từ những thể dị hợp này khụng chỉ biểu hiện ở cõy trồng mà cũn ở cỏc callus trong quỏ trỡnh tỏi sinh in vitro. Vớ dụ như: sự sinh trưởng mạnh mẽ của thể lai callus, hoặc tốc ủộ tỏi sinh chồi khỏc hẳn so với bố mẹ khụng dung hợp, cú thể thấy ủú như một ưu thế lai biểu hiện trong mụi trường in vitro. Khi cỏc cõy nhị bội ủược tạo ra từ thể tứ bội thỡ một số alen gõy chết trong thể tứ
bội cú ủộ dị hợp tử cao này sẽ bộc lộ và bị loại bỏ qua quỏ trỡnh thoỏi húa và bất dục của cõy trồng. Vài alen cú hại tiếp sau quỏ trỡnh chọn lọc ủú một lần nữa
ủược chọn lọc với những giống diploid cú tớnh trạng tốt cho thớ nghiệm dung hợp tế bào trần. Bởi vậy, kết quả lai soma từ dung hợp những dũng diploid cựng loài cú thể chứa ớt alen gõy chết và alen cú hại hơn so với kết quả lai hữu tớnh của hai giống khoai tõy tứ bội và nú cú thể tạo ra ưu thế lai cao.
Năm 1986, Puite và cộng sự [72] ủó tạo ra thể lục bội và bỏt bội từ kết quả
của quỏ trỡnh dung hợp hai dũng lưỡng bội S. tuberosum và S. phureja callus
ủược tạo ra từ quỏ trỡnh dung hợp sinh trưởng mạnh mẽ và cú nhiều ưu thế hơn so với calus bố mẹ của chỳng.
Năm 1985, Austin và cộng sự [43] ủó dung hợp thành cụng hai thể diploid quan trọng của loại S. tuberosum tạo ra thể lai tứ bội và kết quả là tạo ra cullus sinh trưởng tốt.
Năm 1987, Debnath và Wenzel[54] dung hợp một dũng nhị bội
S.tuberosum với 2 dũng nhị bội S.tuberosum. Phần lớn những callus lớn lờn nhanh và ưu thếủược chọn làm thể lai trờn mụi trường tỏi sinh chồi từ 10 ủến 12 tuần sau khi dung hợp. Khi tiến hành kiểm tra nhiễm sắc thể ủó xỏc ủịnh ủược 90% cõy tỏi sinh là thể tứ bội, sau ủú con lai của tất cả cỏc thể lai giảủịnh này
ủược kiểm tra bằng phương phỏp phõn tớch Isoenzyme. Qua quan sỏt thấy thể lai soma này sinh trưởng tốt trong in vitro và trong nhà kớnh, ủỏng chỳ ý là sự tăng
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 36
lờn về trọng lượng, kớch cỡ lỏ và diện tớch lỏ. Ưu thế lai của những thể lai soma này chưa ủược kiểm tra trờn ủồng ruộng.
Năm 1989, Waara và cộng sự [76] ủó tạo ra ủược một số callus từ dung hợp tế bào trần giữa 2 dũng khoai tõy nhị bội (S.tuberosum L.). Những calus sinh trưởng tốt ủược lựa chọn từ 15 callus ủể tỏi sinh chồi. Tuy nhiờn, thực tế
chỉ cú 3 callus của thể lai là tỏi sinh ủược, ủa số chỳng ủược dựng làm bố mẹ
cho nhõn dũng soma. Trong trường hợp này, sự sinh trưởng của callus tạo ra từ
dung hợp tế bào trần của 2 thể nhị bội khụng biểu hiện ưu thế lai. Hơn nữa khụng tạo ra ủược thể tứ bội mà chỉ tạo ra ủược cõy lục bội và tạp bội từ quỏ trỡnh dung hợp.
Trong thớ nghiệm của Waara và cộng sự (1989)[76]. Karlesson và Ericksson (1988)[62] ủó tạo ra ủược một số calus từ quỏ trỡnh dung hợp một số
dũng khoai tõy nhị bội. Sau 2 thỏng nuụi cấy, những calus sinh trưởng tốt ủược chuyển sang mụi trường tỏi sinh chồi.
Năm 1988, Mollers và cộng sự [67] tiến hành dung hợp cỏc dũng khoai tõy nhị bội và tứ bội khỏc nhau và ủó tỏi sinh ủược một số thể lai soma, từủú tạo ra ủược một số dũng xoma bố mẹ. Thể lai tứ bội này ủược biểu hiện ở năng suất củ trung bỡnh cao ở thớ nghiệm so sỏnh trong nhà kớnh.
Sử dụng dung hợp tế bào trần ủể kết hợp cỏc ủặc tớnh sản lượng thấp, chớn muộn với sản lượng cao, chớn sớm, Waara và cộng sự năm 1992[76] ủó tạo ra
ủược những cõy lai tế bào xoma chớn muộn và sản lượng cao. Cỏc cõy lai tế bào xoma tứ bội và lục bội ủều ủược tỏi sinh từ từ ủĩa nuụi tế bào trần dung hợp. Những cõy tứ bội này thể hiện nhiều ủặc ủiểm kiểu hỡnh trung gian của cõy bố
mẹ phỏt riển từ mụ dung hợp. Mặc dự vậy, chỳng cú những ủặc ủiểm cú ý nghĩa như: thõn nhiều giúng hơn, dài hơn, củ nặng hơn, sản lượng củ sinh trưởng phỏt triển của cõy trồng ở cõy lai tế bào xoma.
Năm 1992, Mollers và Wenzel [76] ủó tạo ra 308 cõy lai cựng loài thụng qua 17 thớ nghiệm dung hợp từ những dũng khoai tõy nhị bội. Trong tất cả
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 37
những sự kết hợp ủú, họ khụng tỡm ra ủược ưu thế lai của callus ủể tỏi sinh thành cõy. Khi tỡm hiểu sự sinh trưởng trong nhà kớnh, những cõy lai xoma biểu hiện kớch thước lỏ lớn hơn, cõy cao hơn và ủường kớnh thõn lớn hơn so với những cõy bố mẹ phỏt triển từ mụ dung hợp và cõy tứ bội phỏt triển từ cặp nhiễm sắc thể của cõy lưỡng bội.
Năm 1994, Cooper Ờ Bland [53] ủó sử dụng phương phỏp dung hợp tế bào trần ủể kết hợp 2 dũng nhị bội S. tuberosum cựng loài với những ủặc ủiểm mong muốn như: sản lượng cao, sinh trưởng phỏt triển tốt.
Năm 1994, Moller [70] ủó dung hợp 12 dũng vụ tớnh lưỡng bội khỏc nhau tạo ra 13 cõy lai tế bào xoma ở thể tứ bội, biểu hiện ưu thế lai về sản lượng ở
việc tăng khối lượng củ nhưng khụng tăng số lượng củ, sinh trưởng tốt, ủặc biệt hàm lượng tinh bột trong củ cao hơn giỏ trị trung gian của cõy bố mẹ.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 38