Bước 1: Gắn kháng thể thỏ kháng vi rút LMLM typ cần chẩn ựoán lên ựĩa 96 giếng. Tỷ lệ 1: 500.
Lấy 12 ộl kháng thể thỏ kháng FMDV typ cần chẩn ựoán và 6 ml buffer, cho vào mỗi giếng, ủ qua ựêm ở nhiệt ựộ 4ỨC.
Sơựồ phản ứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 9 9 10 10 11 11 12 12 B C++ C++ 2 2 C C+ C+ 3 3 D C+ C+ 4 4 E C- C- 5 5 F C- C- 6 6 G Ca Ca 7 7 H Ca Ca 8 8 40 40 C++ huyết thanh ựối chứng (+) mạnh C+ huyết thanh ựối chứng (+) vừa C- huyết thanh ựối chứng (-) Ca buffer A Mỗi ựĩa kiểm tra 40 mẫu.
Bước 2: Trung hoà
+ Pha loãng kháng thểựối chứng với tỷ lệ 1: 16 15 ộl C++ + 225 ộl buffer A.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...41 15 ộl C+ + 225 ộl buffer A
15 ộl C- + 225 ộl buffer A Pha trong ống nhựa
+ Pha loãng huyết thanh kiểm tra, tỷ lệ 1: 16.
10 ộl huyết thanh + 150 ộl buffer A, pha trong ống nhựa. + Ủựĩa nhựa:
Cột 1-2: cho huyết thanh ựối chứng ( 4 ô mỗi loại ). 50 ộl/ giếng Cột 3-12: cho 50 ộl huyết thanh kiểm tra ựã pha loảng ( 2ô/mẫu) Cho 50 ộl kháng nguyên ựã biết vào tất cả các giếng, ủở nhiệt ựộ 4ỨC qua ựêm.
Bước 3: Gắn mẫu vào ựĩa phản ứng
Hôm sau rửa ựĩa ựã gắn kháng thể 3 lần. Chuyển 50 ộl/1 ô từ ựĩa trung hoà sang ựĩa phản ứng. Lắc, ủở 37ỨC trong 1 giờ, rửa 3 lần.
Bước 4: Gắn kháng thể phát hiện, tỷ lệ 1: 100.
Pha 55 ộl kháng thể chuột lang kháng FMDV +5,5 ml buffer B. Cho 50 ộl dung dịch này vào từng giếng phản ứng, lắc, ủở 37ỨC trong 1 giờ, rửa 3 lần.
Bước 5: Gắn conjugate, tỷ lệ 1: 200.
30 ộl Conjugate +6 ml buffer B, cho 50 ộl vào mỗi giếng. Lắc, ủ ở 37ỨC/40 phút, rửa 3 lần (giữ Conjugate thừa ựể kiểm tra màu).
Bước 6: Cho Substrate/Chromogen, tỷ lệ 1:200.
Cho 30 ộl H2O2 + 6 ml ODP, cho50 ộl vào các giếng (Blank trước, giếng kiểm tra sau).ủở nhiệt ựộ phòng trong hộp tối trong khoảng 15-30 phút.
Bước7: Dừng phản ứng.
Cho 50 ộl H2SO4 1,25 M vào từng giếng (Blank trước, giếng chứa mẫu sau). đọc kết quả phản ứng trên máy ELISA chương trình Program number 1 với bước sóng 492 nm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...42 OD mẫu xét nghiệm Giá trị % (%PI) = 100 - Trung bình OD của Ca x 100 Nếu giá trị: PI < 50% là âm tắnh PI > 50% là dương tắnh 2.6.2. Phương pháp ựịnh lượng. Sơựồ phản ứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 3 3 5 5 7 7 9 9 B C++ C++ 1 1 C C+ C+ 1 1 D C+ C+ 1 1 E C- C- 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10 F C- C- 2 2 10 10 G Ca Ca 2 2 10 10 H Ca Ca 2 2 10 10 Bước 1: Gắn kháng thể thỏ kháng FMDV lên ựĩa nhựa.
Lấy 6 ộl kháng thể thỏ kháng FMDVserotyp O + 6 ml dung dịch gắn buffer. Cho 50 ộl/ giếng vào 96 giếng của ựĩa ELISA.
Ủở 4ỨC qua ựêm.
Bước 2: Trung hoà
Pha loãng kháng thểựối chứng, tỷ lệ 1: 16.
8 ộl ( C++, C+, C- ) + 120 ộl buffer A (pha trong ống nhựa). Pha loãng huyết thanh kiểm tra, tỷ lệ 1:8.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...43 Ủựĩa nhựa: C++ =huyết thanh ựối chứng (+) mạn C+ = huyết thanh ựối chứng (+) vừa C- = huyết thanh ựối chứng (-) Ca = buffer A Mỗi ựĩa kiểm tra 10 mẫu. Cột 1-2: Cho 30 ộl kháng thể ựối chứng ( C++, C+, C- ) và Ca vào 4 giếng mỗi loại (Ca = buffer A).
Cột 3-12 : cho 30 ộl buffer A/giếng vào 96 giếng.
Sau ựó chuyển 30 ộl huyết thanh kiểm tra vào các hàng A và E rồi pha loãng theo cơ số 2 từ hàng A ựến D, E ựến H. Như vậy huyết thanh kiểm tra lúc này có ựộ pha loãng là 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 ).
Cho 30 ộl kháng nguyên chuẩn O1 Manisa pha loãng 1:70 (pha với buffer A) vào tất cả các giếng. Huyết thanh kiểm tra lúc này có ựộ pha loãng là 1/32, 1/64, 1/128, 1/256.
Ủựĩa nhựa ở 4ỨC qua ựêm.
Bước 3: Gắn mẫu vào ựĩa phản ứng
Rửa ựĩa gắn kháng thể kháng FMDV 3 lần thấm khô. Chuyển 50 ộl / giếng trung hoà sang ựĩa phản ứng. Lắc, ủở 37ỨC trong 1 giờ, sau ựó rửa 3 lần.
Bước 4: Gắn kháng thể phát hiện, tỷ lệ 1: 100
Pha 52 ộl kháng thể chuột lang kháng FMDV + 5200 buffer B. Cho 50 ộl/ giếng vào 96 giếng.
Lắc, ủ 37ỨC trong 1 giờ, rửa 3 lần thấm khô.
Bước 5: Gắn conjugate với tỷ lệ 1: 200 Pha 30 ộl H2O2+ 6 ml ODP.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...44 Ủở nhiệt ựộ phòng trong hộp tối thời gian 15 phút.
Bước 7: Dừng phản ứng
Dùng H2SO4 1,25 M, cho 50 ộl / giếng (ựĩa Blank trước, ựĩa chứa mẫu sau). đọc kết quả phản ứng trên máy ELISA chương trình Program number 1 với kắnh lọc 492 nm.
đọc kết quả giống như phương pháp ựịnh tắnh.
đánh giá kết quả theo tiêu chuẩn của phòng thắ nghiệm tham chiếu LMLM OIE (World Reference Laboratory-Pirbright-Anh Quốc)
- Hiệu giá kháng thể < 1/32 ựược coi là âm tắnh.
- Hiệu giá kháng thể từ 1/32-1/64 là có kháng thể nhưng không ựạt ngưỡng bảo hộ.
- Hiệu giá kháng thể = 1/128 là hiệu giá kháng thểựạt ngưỡng bảo hộ. - Hiệu giá kháng thể≥ 1/256 chắc chắn bảo hộ.