1.6.3.1. Phản ứng trung hoà vi rút
Phản ứng này dùng chẩn ựoán các trường hợp bị bệnh nhẹ, không ựiển hình, phải lấy máu chắt huyết thanh tìm kháng thể.
Nguyên lý: Vi rút LMLM có khả năng kắch thắch cơ thể sản sinh ra kháng thể dịch thể ựặc hiệu, sự kết hợp giữa vi rút và kháng thể dịch thểựặc hiệu làm cho vi rút không còn khả năng gây bệnh.
Kháng nguyên là vi rút LMLM chuẩn nuôi cấy trên môi trường BHK- 21 và gây bệnh tắch tế bào.
Huyết thanh của gia súc nghi mắc bệnh ựược xử lý ở nhiệt ựộ 56ỨC trong 30 phút.
Phản ứng trung hoà vi rút thực hiện trên môi trường tế bào BHK-21 ựược nuôi trong các ựĩa nhựa lỗ nhỏ. để xác ựịnh typ gây bệnh, cho huyết thanh của gia súc nghi mắc bệnh vào 7 ống nghiệm, sau ựó cho vào mỗi ống nghiệm từng typ vi rút LMLM ựã biết với hiệu giá vi rút ựã ựược xác ựịnh là 100 TCID50 (50% Tissue Culture infections) một lượng tương ựương với huyết thanh nghi, rồi cho vào tủ ấm 37ỨC trong khoảng 1 giờ ựể kháng nguyên và kháng thể tác ựộng với nhau. Sau ựó dùng hỗn dịch của từng ống nghiệm cấy vào các dãy lỗ nhựa ựã nuôi cấy tế bào, ựồng thời các lỗ ựối chứng âm không cấy hỗn dịch mà ựể tế bào tiếp tục phát triển và các lỗ ựối
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...26 chứng dương cấy các typ vi rút LMLM tiếp tục ựể tủ ấm 37ỨC trong vòng 2- 3 ngày.
đọc kết quả, nếu lỗựĩa nhựa nào không có hiện tượng huỷ hoại tế bào, giống với lỗựối chứng âm, chứng tỏ lỗựó có kháng thể tương ựương với typ vi rút LMLM, nên vi rút bị kháng thể trung hoà nên không còn khả năng huỷ hoại tế bào. Ngược lại, nếu lỗ ựĩa nào có hiện tượng huỷ hoại tế bào, tức là ở ựó vi rút vẫn còn tác dụng, có khả năng gây bệnh, giống lỗựối chứng dương, chứng tỏ kháng thể không tương ứng với typ vi rút ựó hoặc trong huyết thanh không có kháng thể.
Phản ứng này rất ựặc hiệu, nhạy, và nhanh chóng chỉ cần 2 -3 ngày là cho kết quả. Việc tìm ra kháng thểựặc hiệu ở gia súc chưa ựược tiêm phòng vacxin LMLM ựủ kết luận là con vật có bệnh.
Sau khi ựã ựịnh typ vi rút gây bệnh, người ta pha loãng huyết thanh nghi theo cơ số 2, tức ở các nồng ựộ 1/2, 1/4, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128Ầ Lấy từng ựộ pha loãng huyết thanh này trộn với týp vi rút ựã biết một lượng tương ựương, ựể tủấm 37ỨC trong 1 giờ. Sau ựó lấy hỗn dịch của từng ựộ pha loãng cho vào các dãy lỗ ựĩa nhựa ựã nuôi cấy tế bào, cần có các lỗựối chứng âm và dương ựể so sánh, ựể tủ ấm 37ỨC trong 2 -3 ngày và ựem ra ựọc kết quả hiệu giá kháng thể tương ứng với ựộ pha loãng lớn nhất mà ở ựó tế bào nuôi không bị huỷ hoại.
Phản ứng trung hoà vi rút vừa có tắnh chất ựịnh tắnh vừa có tắnh chất ựịnh lượng nhưng thường có hiện tượng ngưng kết giả.
1.6.3.2. Phản ứng kết hợp bổ thể (CFT- Complement Fixation Test)
Nguyên lý: Dùng các serotyp huyết thanh ựã biết ựể phát hiện typ vi rút gây bệnh [20].
Phản ứng kết hợp bổ thể ựược thực hiện nhờ hai hệ thống: hệ thống dung huyết và hệ thống dung trùng với sự tham gia của bổ thể.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...27 - Huyết thanh miễn dịch của từng serotyp ựược chế trên chuột lang bằng phương pháp gây tối miễn dịch: Tiêm vacxin LMLM của các typ khác nhau vào trong da dưới gan bàn chân từng nhóm chuột lang hai lần (mỗi tuýp 1 nhóm chuột), mỗi lần cách nhau một tháng, sau ựó lấy máu chắt huyết thanh có chứa kháng thể.
- Kháng nguyên là máu gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc dùng bệnh phẩm cấy vào môi trường tế bào tổ chức lấy từ tuyến yên của bò hoặc của lợn, tế bào thận bê non hoặc dòng tế bào có ựộ nhạy tương ựương, khi tế bào nuôi xuất hiện các biến ựổi tế bào thì lấy dịch làm phản ứng kết hợp bổ thể.
Tóm tắt nguyên lý phản ứng: kháng huyết thanh của một trong 7 typ vi rút LMLM ựược pha loãng trong dung dịch ựệm veronal theo bậc 1,5; bắt ựầu từựộ pha loãng 1/16, thể tắch dùng trong phản ứng là 25 ộl. Thêm vào 50 ml có chứa 3 ựơn vị bổ thể, sau ựó thêm 25 ml huyễn dịch bệnh phẩm cần chẩn ựoán. Cuối cùng thêm 25 ml dung dịch hồng cầu ựã pha loãng. Hiệu giá của phản ứng kết hợp bổ thể là nghịch ựảo ựộ pha loãng của huyết thanh tạo nên dung huyết 50%. Hiệu giá của phản ứng kết hợp bổ thể >36 ựược coi là phản ứng dương tắnh.
Phản ứng kết hợp bổ thể cũng ựã ựược hoàn thiện rất kỹ và khi sử dụng thành thục nó sẽ là một phương tiện hữu hiệu ựể chẩn ựoán phân biệt giữa vi rút LMLM và các vi rút gây viêm miệng mụn nước khác. Tuy vậy một số tác giả cho rằng, dùng phản ứng kết hợp bổ thể ựể phân biệt các typ với nhau kém hiệu quả. Tác giả người Anh là Brooksby (1952) ựã nghiên cứu, hoàn thiện phương pháp này lại cho rằng có thể dùng phản ứng kết hợp bổ thể ựể chẩn ựoán các typ vi rút LMLM với nhau.
Phản ứng kết hợp bổ thể là phản ứng thông thường ựược dùng ựể phát hiện bệnh LMLM, vì ựơn giản, cho kết quả nhanh, chắnh xác và ắt tốn kém.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...28 Nguyên lý: Dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym, rồi cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, sau ựó cho cơ chất vào, cơ chất bị enzym phân huỷ tạo màu và khi so màu trong quang phổ kế sẽ ựịnh lượng ựược mức ựộ phản ứng.
Phản ứng ELISA có ựộ chắnh xác cao do vậy hiện nay nó ựược dùng ựể chẩn ựoán bệnh LMLM [38]. Phản ứng ELISA hay ựược dùng hơn so với phản ứng KHBT vì nó ựặc hiệu và nhạy hơn, cũng như nó không bị ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường hoặc ức chế bổ thể [22].
Phản ứng ELISA trực tiếp dùng ựể phát hiện kháng nguyên
Bước 1: Cố ựịnh kháng thể ựặc hiệu lên phiến chất dẻo, rửa nước ựể loại bỏ kháng thể không gắn.
Bước 2: Cho huyễn dịch bệnh phẩm ựã chiết xuất hoà tan (kháng
nguyên) lên. Nếu có kháng nguyên tương ứng, chúng sẽ gắn với kháng thể ựặc hiệu, rửa nước ựể loại bỏ kháng thể thừa.
Bước 3: Cho kháng thểựã gắn enzym vào.
Nếu ở bước 2 ựã có sự kết hợp giữa kháng nguyên với kháng thểựặc hiệu, thì ở bước 3 này sẽ xẩy ra kết hợp lần thứ hai của kháng nguyên với kháng thểựánh dấu enzym, rửa nước loại bỏ kháng thểựánh dấu thừa.
Bước 4: Tiếp tục cho cơ chất tương ứng với enzym vào. đánh giá kết quả:
- Có màu tức là có kháng nguyên tương ứng, kết luận phản ứng dương tắnh.
- Không có màu tức là kháng nguyên không tương ứng, cho nên kháng nguyên bị rửa trôi từ bước 2, do ựó không có sự kết hợp: kháng thể- kháng nguyên-kháng kháng thể, kết luận phản ứng âm tắnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...29 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 1: Ta gắn kháng nguyên ựã biết lên phiến chất dẻo, rửa nước ựể loại bỏ kháng nguyên thừa.
Bước 2: đưa huyết thanh cần chẩn ựoán lên. Nếu có kháng thể tương ứng với kháng nguyên chuẩn thì sẽ có kết hợp kháng nguyên-kháng thể, rửa nước loại bỏ kháng thể thừa.
Bước 3: Cho kháng kháng thể tương ứng ựã gắn enzym vào. Nếu ựã có kết hợp kháng nguyên-kháng thểở bước 2 thì sẽ tiếp tục có kết hợp kháng nguyên-kháng thể-kháng kháng thể gắn enzym và khi rửa nước không bị trôi.
Bước 4: Cho cơ chất tương ứng với enzym vào. đánh giá kết quả:
Nếu enzym phân huỷ cơ chất tạo màu là phản ứng dương tắnh, huyết thanh nghi có kháng thể tương ứng.
Trong trường hợp huyết thanh không có kháng thể tương ứng với kháng nguyên, sẽ không có kết hợp kháng nguyên-kháng thể ở bước 2, khi cho kháng kháng thể vào sẽ không có kết hợp kháng nguyên-kháng thể-kháng kháng thể, khi rửa nước kháng kháng thể (gắn enzym) bị trôi và cho cơ chất và thì không có enzym phân huỷ, nên không có màu, phản ứng âm tắnh.
Hiện nay phản ứng ELISA là một phản ứng chẩn ựoán nhanh dùng cho bệnh LMLM cũng như trong giám ựịnh serotyp của vi rút. Phản ứng này có những thuận lợi hơn hẳn các phản ứng thông thường khác. đây là một phản ứng có tắnh ựặc hiệu cao và khi dùng với một kháng thểựơn dòng, có thểựây là một kỹ thuật nhạy nhất với mục ựắch chẩn ựoán và ựịnh typ [22].
1.6.3.4. Các phản ứng huyết thanh học khác
Ngoài những phản ứng trên còn một số phản ứng huyết thanh học khác như KHBT gián tiếp (Tekerleka, 1976; Sasaki, 1977) và ngăn trở ngưng kết hồng cầu (Brooth, 1975) cũng cho kết quả tương tự với phản ứng trung hoà về ựộ nhạy cũng như tắnh ựặc hiệu ựể phát hiện vi rút. Cũng có thể ựịnh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...30 typ vi rút LMLM bằng phản ứng kháng thể huỳnh quang (Sugimura, 1976) cũng như kỹ thuật phóng xạ (Crowther, 1976).