3. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. điều tra một số chỉ tiêu liên quan ựến chăn nuôi và dịch cúm gia cầm
tại năm huyện (Sóc Sơn, đông Anh, Gia Lâm, Từ Liêm, Thanh Trì) Ngoại
thành Hà Nội.
- điều tra hồi cứu số lượng gia cầm của năm huyện một số năm gần ựây. - điều tra hồi cứu thiệt hại kinh tế do bệnh cúm gia cầm gây ra của năm huyện một số năm gần ựây.
- điều tra hồi cứu tỷ lệ tiêm phòng 2 năm gần ựây của năm huyện.
2.2.2. Giám sát một số chỉ tiêu của ựàn gia cầm sau tiêm phòng vaccine tại
năm huyện.
- Giám sát lâm sàng: theo dõi ựộ an toàn của vaccine, ảnh hưởng của vaccine ựến tỷ lệựẻ của ựàn gia cầm.
+ đánh giá ựáp ứng miễn dịch, Biến ựộng hiệu giá kháng thể của
ựàn gà tại các thời ựiểm một tháng, ba tháng, năm tháng sau tiêm vaccine.
+ đánh giá ựáp ứng miễn dịch, biến ựộng hiệu giá kháng thể của
ựàn vịt sau khi tiêm vaccine.
+ Kiểm tra sự lưu hành của virus cúm H5N1 trên ựàn gà, vịt ựược tiêm vaccine.
SƠđỒ GIÁM SÁT HUYẾT THANH VÀ VIRUS HỌC
Huyết thanh Dịch swab
Phát hiện kháng thể (H1) Phát hiện virus Phân lập virus RT-PCR (RRT-PCR) Phân lập lần 2 Giám ựịnh (HI) Phân lập virus Kết luận Mẫu Bệnh phẩm (-) (+) (-) (+)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp thu thập số liệu, ựiều tra hiện trạng, lấy mẫu ngẫu nhiên, khách quan, trung thực.
- Phương pháp vận chuyển, bảo quản, sử dụng vaccine và kỹ thuật tiêm phòng thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất vaccine.
- Xác ựịnh hiệu giá kháng thể và ựộ dài miễn dịch của gà, vịt ựược tiêm vaccine bằng phản ứng HI.
- Giám ựịnh virus cúm gia cầm chủng H5N1 bằng phản ứng RT-PCR. - Xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê sinh học trên Excel.
*Giám ựịnh virus phân lập bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu
HI:
- Pha kháng nguyên 4HA/25 ộl: Lấy ựộ pha loãng cuối cùng có phản ứng ngưng kết hồng cầu nhân với 4.
- Tiến hành phản ứng HI: Trên 1 ựĩa chữ V (96 giếng) có thể tiến hành phản ứng HI với nhiều kháng huyết thanh của các subtyp khác nhau.
+ Nhỏ 25 ộl PBS vào các giếng của ựĩa.
+ Nhỏ tiếp 25 ộl kháng huyết thanh vào giếng ựầu tiên.
+ Pha loãng kháng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 ộl kháng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự ựến giếng 12 và bỏ ựi 25 ộl cuối cùng.
+ Nhỏ 25 ộl kháng nguyên 4HA ựã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 2 ựến giếng 12. Thêm 25 ộl PBS vào hàng ựối chứng hồng cầu (giếng1).
+ Lắc ựĩa và ựểở nhiệt ựộ phòng 20 - 30 phút.
+ Nhỏ 25 ộl dung dịch hồng cầu (1%) vào tất cả các giếng của ựĩa. + Lắc ựều ựểựĩa ở nhiệt ựộ phòng 40 phút sau ựó ựọc kết quả.
- đọc kết quả: Hồng cầu lắng xuống ựáy cho kết quả phản ứng dương tắnh. Tức là, virus phân lập và kháng huyết thanh chuẩn tương ứng với nhau.
- Theo quy ựịnh 1361/KTY - DT ngày 02/12/2005 của Bộ NN & PTNT: Ngưỡng bảo hộ có hiệu giá (HI) = 4log2.
Không ựược bảo hộ có hiệu giá (HI) < 4log2
* Phương pháp phân lập virus cúm trên trứng gà có phôi:
Chuẩn bị bệnh phẩm trước khi phân lập:
- Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khắ quản
+ Lắc mạnh ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc Vortexmixer. + Bỏ tăm bông ra khỏi ống dịch ngoáy.
+ Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh ựậm ựặc, lắc ựều. + để mẫu lắng cặn khoảng 30 phút ở nhiệt ựộ phòng.
+ Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh ựậm ựặc, chuyển sang ống ly tâm. Ly tâm với tốc ựộ 400g (2.000 vòng /phút) trong 10 phút.
+ Thu dịch nổi.
Tiến hành phân lập:
- Chọn trứng có phôi 9 - 10 ngày tuổi khoẻ mạnh, 3 trứng /bệnh phẩm. - Lau trứng bằng cồn 70% và ựục lỗ nhỏ phắa trên buồng hơi.
- Dùng seringe 1 ml lắp kim và hút dịch bệnh phẩm (ựã xử lý ở trên) tiêm vào xoang niệu mô với lượng 0,2 ml/trứng.
- Gắn vết tiêm bằng keo dán.
- Ấp trứng tiếp 2 - 3 ngày ở nhiệt ựộ 370C.
- Theo dõi sau khi tiêm, soi trứng ngày 2 lần. Những trứng chết ựược cất vào tủ lạnh 40C ựể kiểm tra.
Thu hoạch nước trứng sau khi phân lập:
- Ấp trứng chết hoặc sống ựược cất vào tủ lạnh 40C qua ựêm hoặc ắt nhất 4 giờ trước khi thu hoạch.
- Lau trứng bằng cồn 70%.
- Dùng kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu mô sang bên.
- Thu dịch niệu mô vào ống nghiệm (thu hoạch riêng trứng sống và chết). - Mẫu ựã phân lập ựược kiểm tra bằng phản ứng HA.
* Phản ứng Real time RT - PCR:
- Nước cất vô trùng (Rnase - free).
- ARN ựối chứng dương tắnh M, H5 và H7. - Cồn tuyệt ựối.
- Isopropanol 99% tinh khiết. - Chloroform 99% tinh khiết.
- Trizol LS reagent (Invitrogen, cat #10296 - 010 hoặc 10296 - 028). - Kit chiết tách Qiagen Rneasy Extraction (cat # 74104 50 prep hoặc #74106 250 prep).
- Kit RT - PCR 1 bước Qiagen (cat # 210210 hoặc 210212) hoặc Superscript RT - PCR One - Step RT - PCR với Platinium Taq DNA Polymerase (cat 10928 - 034 hoặc 10928 - 042, Invitrogen).
- Mẫu dò và primer.
Bảng 2.1. Trình tự chuỗi của mẫu giò và Primer cho RTRT Ờ PCR phát hiện cúm gia cầm
đặc hiệu Ký hiệu Trình tự chuỗi
M + 25* 5Ỗ Primer
5Ỗ- AgA TgA gTC TTC TAA CCg Agg TCg - 3Ỗ M + 64*
Mẫu dò
5Ỗ- FAM - TCA ggC CCC CTC AAA gCC gA - TAMRA - 3Ỗ M - 124* M (cho bất kỳ cúm A) 3ỖPrimer
5Ỗ- TgC AAA AAC ATC TTC Aag TCT CTg - 3Ỗ H7+ 1244*
5Ỗ Primer
5Ỗ- ATT ggA CAC gAg ACg CAA Tg - 3Ỗ H7 + 1281*
Mẫu dò
5Ỗ- FAM - TAA TgC TgA gCT gTT ggT ggC - TAMRA - 3Ỗ
H7 - 1342* H7
(BắcMỹ)
3ỖPrimer
5Ỗ- TTC TgA gTC CgC AAg ATC TAT Tg - 3Ỗ H5 + 1456*
5Ỗ Primer
5Ỗ- ACg TAT gAC TAT CCA CAA TAC TCA - 3Ỗ H5
Mẫu dò -TAMRA - 3Ỗ H5 - 1685*
3ỖPrimer
5Ỗ- AgA CCA gCT ACC ATg ATT gC - 3Ỗ - Rnase Inhibitor, 40 unit/ộl (Promega, cat # N2511 hoặc N2515). - MgCl2, 25ộM (Promega, cat # A3511 hoặc A3513).
- đệm TE pH 8.0, 1X, (Promega # V6231 hoặc V6232). - 14.3 M *β - mercaptoethanol (β - ME) (Sigma M6250).
- Hoạt chất phản ứng M và H5 cho AIV RRT - PCR ựã ựược chuẩn bị bởi Cepheid ựể sử dụng cho các xét nghiệm M và H5. Mỗi hoạt chất phản ứng ựủ
cho 4 phản ứng loại 25ộl. Mỗi giọt chứa primer và mẫu dò ựặc hiệu, KCl, MgCl2, và ựệm HEPES. Thêm vào ựó giọt M gồm cả chất ựiều khiển trong (IC). Mục ựắch của IC là phát hiện một âm tắnh giả tạo ra từ các chất ức chế không
ựặc hiệu của quá trình phân gen.
- Chất ựiều khiển trong M là một ARN chuỗi ựơn phiên mã dài 228 base. Nó chứa chuỗi bổ sung với primer tiến ở ựầu 5Ỗ và primer lùi ở ựầu 3Ỗ và một chuỗi bên trong (internal) ựể gắn với mẫu dò IC. Hạt M gồm có một mẫu dò ựánh dấu F ựể phát hiện gen M, và mẫu dò ựánh dấu Cal - Flour Red 610 cho IC.
- Hạt chất phản ứng H5 gồm có 2 primer tiến, một ựể phát hiện AIV H5
dòng Bắc Mỹ và một ựể phát hiện AIV H5 dòng Âu - Á chất phản ứng H5, một mẫu dò H5 ựánh dấu FAM phát hiện ựược cả 2 dòng. Chất phản ứng ựược chia vào các ống 0,5ộl có thể sử dụng ựể hoàn nguyên. Chất phản ứng ựược sử dụng với dNTP và enzyme của kit Qiagen RT - PCR onestep. Chất phản ứng có thể
bảo quản trong túi thiếc ở 40C trong 6 tháng không cởi bỏ túi nếu chưa sử dụng.
* Các bước tiến hành :
Trước khi làm RTRT-PCR, ựặt các pipet, khay, ựầu pipet,... vào buồng vô trùng sạch. Tương tự, ựặt các dụng cụ làm mẫu vào buồng vô trùng khác. Bật
ựèn tử ngoại trong nhiều giờ hoặc qua ựêm ựể giảm tạp nhiễm ARN từ pipet và các dụng cụ khác.
+ Lắc mạnh (bằng máy Votex) ống chứa dịch ngoáy và chuyển lượng 500 ộl sang ống ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫu.
+ Cho 500 ộl Qiagenự buffer RLT có β - ME vào ống ly tâm trên. Lắc ựều trên máy Votex.
+ Ly tâm (bằng máy Spindown) ựể dịch bệnh phẩm ựọng trên nắp trôi xuống ựáy ống. Cho 500 ộl cồn ethanol 70%, lắc mạnh bằng Votex. Ly tâm lấy mẫu ựã bị dung dải trong vòng 5 phút với tốc ựộ 5000 vòng ở nhiệt ựộ phòng. + Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung dải sang cột RNeasy Qiagen ựã ghi sẵn kắ hiệu mẫu. Ly tâm trong vòng 15 giây tốc ựộ≥ 8000 vòng ở nhiệt ựộ
phòng. Kiểm tra dịch mẫu ựã thấm qua cột lọc chưa, lặp lại bước này cho ựến khi toàn bộ mẫu ựã qua cột lọc.
+ Bổ sung 700 ộl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc ựộ ≥ 8000 vòng, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc.
+ Cho 500 ộl RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 giây ở tốc ựộ ≥ 8000 vòng, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.
+ Lặp lại bước trên 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cùng thay ống thu mẫu mới loại 2ộl vào cột lọc.
+ Ly tâm cột lọc trống không trong 2 phút ở tốc ựộ tối ựa (khoảng 12.000 vòng /phút), bỏống thu mẫu.
+ đặt cột lọc vào ống thu hoạch ựã ựược ghi sẵn ký hiệu mẫu. Cho 50ộl RNase free H2O vào cột lọc. Chú ý không ựược chạm ựầu pipet vào mặt thạch Silica trong cột lọc, ủ ở nhiệt ựộ phòng trong ắt nhất 1 phút. Tách RNA bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở 10.000 vòng /phút. Bỏ cột lọc RNeasy.
+ Bảo quản mẫu ARN thu ựược ở 40C trong thời gian ngắn trước khi làm RTRT - PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở - 200C hoặc nhiệt ựộ thấp hơn.
+ Cho 0,75 ml Trizol LS reagent (hoặc 1ml Trizol reagent) và 0,25 ml dịch bệnh phẩm (0,1 ml dịch bệnh phẩm nếu dùng Trizol reagent) vào ống 1,5 ml. lắc ựều và ựểở nhiệt ựộ phòng 5 phút.
+ Thêm 0,2 ml chloroform vào mỗi ống. Lắc mạnh trong 15 giây và ựể ở
nhiệt ựộ phòng 5 phút.
+ Ly tâm ống ở nhiệt ựộ 12.000g trong 15 phút ở 40C.
+ Chuyển phần nước (khoảng 500 ộl) sang ống microtube mới.
+Thêm 0,5 ml Isopropanol và lắc ựều. để 5 - 10 phút ở nhiệt ựộ phòng. + Ly tâm ống ở tốc ựộ 10.000 vòng trong 5 phút ở 40C, bỏ dung dịch trong
ống ựi.
+ Rửa ARN ựọng ởựáy ống bằng cồn 80%, lắc mạnh và ly tâm với tốc
ựộ 10.000 vòng trong 5 phút ở 40C.
+ Bỏ dung dịch trong ống và làm khô ARN 10 phút ở nhiệt ựộ phòng và hoà tan lại với 30 ộl nước cất không có RNase hoặc nước cất ựã xử lý DEPC. - Sao mã ngược và PCR:
+ Trong buồng vô trùng sạch, chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (master mix) với các thành phần sau ựủ dùng cho số lượng mẫu cần xét nghiệm.
+ Quy trình này ựược áp dụng cho máy nhân gen Cepheid Smart Cycler (Cephied, Sunnyvale, CA).
+ Thông tin về khởi ựộng và cài ựặt chương trình cho máy Smart Cycler có trong quyển hướng dẫn của hãng. Chếựộ chạy RT - PCR cho máy Smart Cycler ựược hướng dẫn trong bảng 2 và 3.
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của bước phiên mã ngược (RT) dùng cho Quiagen one step RT - PCR kit
Bước phiên mã ngược Thời gian (phút) Nhiệt ựộ (0C) 30 50 Một chu kỳ 15 95
Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho tổng hợp gen và các cặp mồi
Cặp mồi Chu kỳ Bước Thời gian
(giây) Nhiệt ựộ (0C) AIV matrix 45 Biến tắnh 1 94 Bám của cặp mồi 20 60 Biến tắnh 1 94 H7 40 Bám của cặp mồi 20 58 Biến tắnh 1 94 Bám của cặp mồi 20 57 H5 40
Kéo dài chuỗi tổng hợp 5 72 (Chú ý: Màu huỳnh quang ựược xác ựịnh ở bước bám gắn của cặp mồi).
Phản ứng RTRT - PCR ựược tiến hành với những thành phần sau cùng với cặp mồi và chu kỳ thắch hợp. Khởi ựộng phản ứng với các ống phản ứng ựược
ựặt trong giá ựựng ống lạnh và dùng các ựầu pipet có lọc.
Ớ Các bước tiến hành phản ứng PCR:
Bước 1: Trộn dung dịch Master mix (MM) tùy theo lượng mẫu thắ nghiệm. Số
lượng thành phần dung dịch MM trên một mẫu bệnh phẩm là : Rw (nước tinh khiết): 5,5ộl.
2X (nguyên liệu): 12,5ộl.
PPP (probe, primer xuôi và ngược): 1,5ộl. E (enzyme): 0,5ộl.
Bước 2: - Trộn 20 ộl hỗn hợp MM với 5 ộl mẫu thắ nghiệm, lắc ựều bằng máy rung Votex.
- Cho 25 ộl mẫu ựối chứng vào ống ựối chứng dương. Cho 25 ộl nước cất vào ống ựối chứng âm.
Bước 3: đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR, bắt ựầu chạy, nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu ựối chứng dương tắnh, âm tắnh vào phần cuối ký hiệu mẫu trong bảng kết quả. Lưu chương trình
- Phân tắch kết quả xét nghiệm:
+ Giá trị Ct của ựối chứng dương tắnh ARN ựược sao mã: đối chứng dương tắnh ARN ựã sao mã ựược pha loãng ở hàm lượng sử dụng cho giá trị Ct
khoảng 25. Khi ựối chứng dương có Ct cao hơn 29 thì phải làm lại ựể xét nghiệm ựảm bảo. Nếu Ct của ựối chứng dương tắnh thấp hơn 20, nên pha chuẩn
ựộ lại ựộ pha loãng của ựối chứng. Bất kỳ thời ựiểm nào Ct của ựối chứng dương tắnh hoặc ựường cong tăng trưởng khác thấp hơn 14, giá trị trừ nền có thể bị sai lệch.
+ Giám ựịnh các mẫu dương tắnh yếu: Loại bỏ tất cả phản ứng lớn hơn 100 ựơn vị tăng huỳnh quang từ trong ựồ thị (ựiều này làm thay ựổi thước ựo ựể
dễ xác ựịnh các trường hợp dương tắnh yếu. Quan sát riêng từng mẫu sẽ giúp cho phát hiện các phản ứng dương tắnh yếu.
+ Những mẫu có Ct bằng 35 hoặc lớn hơn ựược xem là dương tắnh nghi ngờ và ựược xét nghiệm lại.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tình hình chăn nuôi gia cầm, diễn biến dịch cúm gia cầm của Sóc Sơn,
đông Anh, Gia Lâm, Thanh Trì, Từ Liêm
3.1.1. Tình hình chăn nuôi gia cầm của năm huyện: Sóc Sơn, đông Anh, Gia Lâm, Thanh Trì, Từ Liêm
Hà Nội là thủ ựô, ựồng thời là thành phố ựứng ựầu Việt Nam về diện tắch và thứ hai về dân số với 6,449 triệu người. Sau ựợt mở rộng ựịa giới hành chắnh vào tháng 8 năm 2008, Hà Nội hiện nay có diện tắch 3.324,92 kmỗ, gồm một thị
xã, 10 quận và 18 huyện ngoại thành.
Nằm ở phắa tây bắc của vùng ựồng bằng châu thổ sông Hồng, Hà Nội có vị trắ từ 20ồ53' ựến 21ồ23' vĩựộ Bắc và 105ồ44' ựến 106ồ02' kinh ựộ đông, tiếp giáp với các tỉnh Thái Nguyên, Vĩnh Phúc ở phắa Bắc, Hà Nam, Hòa Bình phắa Nam, Bắc Giang, Bắc Ninh và Hưng Yên phắa đông, Hòa Bình cùng Phú Thọ
phắa Tây. Sau ựợt mở rộng ựịa giới hành chắnh vào tháng 8 năm 2008, thành phố