3. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn
2.3.Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp thu thập số liệu, ñiều tra hiện trạng, lấy mẫu ngẫu nhiên, khách quan, trung thực.
- Phương pháp vận chuyển, bảo quản, sử dụng vaccine và kỹ thuật tiêm phòng thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất vaccine.
- Xác ñịnh hiệu giá kháng thể và ñộ dài miễn dịch của gà, vịt ñược tiêm vaccine bằng phản ứng HI.
- Giám ñịnh virus cúm gia cầm chủng H5N1 bằng phản ứng RT-PCR. - Xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê sinh học trên Excel.
*Giám ñịnh virus phân lập bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu
HI:
- Pha kháng nguyên 4HA/25 µl: Lấy ñộ pha loãng cuối cùng có phản ứng ngưng kết hồng cầu nhân với 4.
- Tiến hành phản ứng HI: Trên 1 ñĩa chữ V (96 giếng) có thể tiến hành phản ứng HI với nhiều kháng huyết thanh của các subtyp khác nhau.
+ Nhỏ 25 µl PBS vào các giếng của ñĩa.
+ Nhỏ tiếp 25 µl kháng huyết thanh vào giếng ñầu tiên.
+ Pha loãng kháng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 µl kháng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự ñến giếng 12 và bỏ ñi 25 µl cuối cùng.
+ Nhỏ 25 µl kháng nguyên 4HA ñã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 2 ñến giếng 12. Thêm 25 µl PBS vào hàng ñối chứng hồng cầu (giếng1).
+ Lắc ñĩa và ñểở nhiệt ñộ phòng 20 - 30 phút.
+ Nhỏ 25 µl dung dịch hồng cầu (1%) vào tất cả các giếng của ñĩa. + Lắc ñều ñểñĩa ở nhiệt ñộ phòng 40 phút sau ñó ñọc kết quả.
- ðọc kết quả: Hồng cầu lắng xuống ñáy cho kết quả phản ứng dương tính. Tức là, virus phân lập và kháng huyết thanh chuẩn tương ứng với nhau.
- Theo quy ñịnh 1361/KTY - DT ngày 02/12/2005 của Bộ NN & PTNT: Ngưỡng bảo hộ có hiệu giá (HI) = 4log2.
Không ñược bảo hộ có hiệu giá (HI) < 4log2
* Phương pháp phân lập virus cúm trên trứng gà có phôi:
Chuẩn bị bệnh phẩm trước khi phân lập:
- Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản
+ Lắc mạnh ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc Vortexmixer. + Bỏ tăm bông ra khỏi ống dịch ngoáy.
+ Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh ñậm ñặc, lắc ñều. + ðể mẫu lắng cặn khoảng 30 phút ở nhiệt ñộ phòng.
+ Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh ñậm ñặc, chuyển sang ống ly tâm. Ly tâm với tốc ñộ 400g (2.000 vòng /phút) trong 10 phút.
+ Thu dịch nổi.
Tiến hành phân lập:
- Chọn trứng có phôi 9 - 10 ngày tuổi khoẻ mạnh, 3 trứng /bệnh phẩm. - Lau trứng bằng cồn 70% và ñục lỗ nhỏ phía trên buồng hơi.
- Dùng seringe 1 ml lắp kim và hút dịch bệnh phẩm (ñã xử lý ở trên) tiêm vào xoang niệu mô với lượng 0,2 ml/trứng.
- Gắn vết tiêm bằng keo dán.
- Ấp trứng tiếp 2 - 3 ngày ở nhiệt ñộ 370C.
- Theo dõi sau khi tiêm, soi trứng ngày 2 lần. Những trứng chết ñược cất vào tủ lạnh 40C ñể kiểm tra.
Thu hoạch nước trứng sau khi phân lập: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Ấp trứng chết hoặc sống ñược cất vào tủ lạnh 40C qua ñêm hoặc ít nhất 4 giờ trước khi thu hoạch.
- Lau trứng bằng cồn 70%.
- Dùng kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu mô sang bên.
- Thu dịch niệu mô vào ống nghiệm (thu hoạch riêng trứng sống và chết). - Mẫu ñã phân lập ñược kiểm tra bằng phản ứng HA.
* Phản ứng Real time RT - PCR:
- Nước cất vô trùng (Rnase - free).
- ARN ñối chứng dương tính M, H5 và H7. - Cồn tuyệt ñối.
- Isopropanol 99% tinh khiết. - Chloroform 99% tinh khiết.
- Trizol LS reagent (Invitrogen, cat #10296 - 010 hoặc 10296 - 028). - Kit chiết tách Qiagen Rneasy Extraction (cat # 74104 50 prep hoặc #74106 250 prep).
- Kit RT - PCR 1 bước Qiagen (cat # 210210 hoặc 210212) hoặc Superscript RT - PCR One - Step RT - PCR với Platinium Taq DNA Polymerase (cat 10928 - 034 hoặc 10928 - 042, Invitrogen).
- Mẫu dò và primer.
Bảng 2.1. Trình tự chuỗi của mẫu giò và Primer cho RTRT – PCR phát hiện cúm gia cầm
ðặc hiệu Ký hiệu Trình tự chuỗi
M + 25* 5’ Primer
5’- AgA TgA gTC TTC TAA CCg Agg TCg - 3’ M + 64*
Mẫu dò
5’- FAM - TCA ggC CCC CTC AAA gCC gA - TAMRA - 3’ M - 124* M (cho bất kỳ cúm A) 3’Primer
5’- TgC AAA AAC ATC TTC Aag TCT CTg - 3’ H7+ 1244*
5’ Primer
5’- ATT ggA CAC gAg ACg CAA Tg - 3’ H7 + 1281*
Mẫu dò
5’- FAM - TAA TgC TgA gCT gTT ggT ggC - TAMRA - 3’
H7 - 1342* H7
(BắcMỹ)
3’Primer
5’- TTC TgA gTC CgC AAg ATC TAT Tg - 3’ H5 + 1456*
5’ Primer
5’- ACg TAT gAC TAT CCA CAA TAC TCA - 3’ H5
Mẫu dò -TAMRA - 3’ H5 - 1685*
3’Primer (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5’- AgA CCA gCT ACC ATg ATT gC - 3’ - Rnase Inhibitor, 40 unit/µl (Promega, cat # N2511 hoặc N2515). - MgCl2, 25µM (Promega, cat # A3511 hoặc A3513).
- ðệm TE pH 8.0, 1X, (Promega # V6231 hoặc V6232). - 14.3 M *β - mercaptoethanol (β - ME) (Sigma M6250).
- Hoạt chất phản ứng M và H5 cho AIV RRT - PCR ñã ñược chuẩn bị bởi Cepheid ñể sử dụng cho các xét nghiệm M và H5. Mỗi hoạt chất phản ứng ñủ
cho 4 phản ứng loại 25µl. Mỗi giọt chứa primer và mẫu dò ñặc hiệu, KCl, MgCl2, và ñệm HEPES. Thêm vào ñó giọt M gồm cả chất ñiều khiển trong (IC). Mục ñích của IC là phát hiện một âm tính giả tạo ra từ các chất ức chế không
ñặc hiệu của quá trình phân gen.
- Chất ñiều khiển trong M là một ARN chuỗi ñơn phiên mã dài 228 base. Nó chứa chuỗi bổ sung với primer tiến ở ñầu 5’ và primer lùi ở ñầu 3’ và một chuỗi bên trong (internal) ñể gắn với mẫu dò IC. Hạt M gồm có một mẫu dò ñánh dấu F ñể phát hiện gen M, và mẫu dò ñánh dấu Cal - Flour Red 610 cho IC.
- Hạt chất phản ứng H5 gồm có 2 primer tiến, một ñể phát hiện AIV H5
dòng Bắc Mỹ và một ñể phát hiện AIV H5 dòng Âu - Á chất phản ứng H5, một mẫu dò H5 ñánh dấu FAM phát hiện ñược cả 2 dòng. Chất phản ứng ñược chia vào các ống 0,5µl có thể sử dụng ñể hoàn nguyên. Chất phản ứng ñược sử dụng với dNTP và enzyme của kit Qiagen RT - PCR onestep. Chất phản ứng có thể
bảo quản trong túi thiếc ở 40C trong 6 tháng không cởi bỏ túi nếu chưa sử dụng.
* Các bước tiến hành :
Trước khi làm RTRT-PCR, ñặt các pipet, khay, ñầu pipet,... vào buồng vô trùng sạch. Tương tự, ñặt các dụng cụ làm mẫu vào buồng vô trùng khác. Bật
ñèn tử ngoại trong nhiều giờ hoặc qua ñêm ñể giảm tạp nhiễm ARN từ pipet và các dụng cụ khác.
+ Lắc mạnh (bằng máy Votex) ống chứa dịch ngoáy và chuyển lượng 500 µl sang ống ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫu.
+ Cho 500 µl Qiagenñ buffer RLT có β - ME vào ống ly tâm trên. Lắc ñều trên máy Votex.
+ Ly tâm (bằng máy Spindown) ñể dịch bệnh phẩm ñọng trên nắp trôi xuống ñáy ống. Cho 500 µl cồn ethanol 70%, lắc mạnh bằng Votex. Ly tâm lấy mẫu ñã bị dung dải trong vòng 5 phút với tốc ñộ 5000 vòng ở nhiệt ñộ phòng. + Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung dải sang cột RNeasy Qiagen ñã ghi sẵn kí hiệu mẫu. Ly tâm trong vòng 15 giây tốc ñộ≥ 8000 vòng ở nhiệt ñộ
phòng. Kiểm tra dịch mẫu ñã thấm qua cột lọc chưa, lặp lại bước này cho ñến khi toàn bộ mẫu ñã qua cột lọc.
+ Bổ sung 700 µl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc ñộ ≥ 8000 vòng, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc.
+ Cho 500 µl RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 giây ở tốc ñộ ≥ 8000 vòng, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.
+ Lặp lại bước trên 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cùng thay ống thu mẫu mới loại 2µl vào cột lọc.
+ Ly tâm cột lọc trống không trong 2 phút ở tốc ñộ tối ña (khoảng 12.000 vòng /phút), bỏống thu mẫu.
+ ðặt cột lọc vào ống thu hoạch ñã ñược ghi sẵn ký hiệu mẫu. Cho 50µl RNase free H2O vào cột lọc. Chú ý không ñược chạm ñầu pipet vào mặt thạch Silica trong cột lọc, ủ ở nhiệt ñộ phòng trong ít nhất 1 phút. Tách RNA bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở 10.000 vòng /phút. Bỏ cột lọc RNeasy.
+ Bảo quản mẫu ARN thu ñược ở 40C trong thời gian ngắn trước khi làm RTRT - PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở - 200C hoặc nhiệt ñộ thấp hơn.
+ Cho 0,75 ml Trizol LS reagent (hoặc 1ml Trizol reagent) và 0,25 ml dịch bệnh phẩm (0,1 ml dịch bệnh phẩm nếu dùng Trizol reagent) vào ống 1,5 ml. lắc ñều và ñểở nhiệt ñộ phòng 5 phút.
+ Thêm 0,2 ml chloroform vào mỗi ống. Lắc mạnh trong 15 giây và ñể ở
nhiệt ñộ phòng 5 phút.
+ Ly tâm ống ở nhiệt ñộ 12.000g trong 15 phút ở 40C.
+ Chuyển phần nước (khoảng 500 µl) sang ống microtube mới.
+Thêm 0,5 ml Isopropanol và lắc ñều. ðể 5 - 10 phút ở nhiệt ñộ phòng. + Ly tâm ống ở tốc ñộ 10.000 vòng trong 5 phút ở 40C, bỏ dung dịch trong
ống ñi.
+ Rửa ARN ñọng ởñáy ống bằng cồn 80%, lắc mạnh và ly tâm với tốc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ñộ 10.000 vòng trong 5 phút ở 40C.
+ Bỏ dung dịch trong ống và làm khô ARN 10 phút ở nhiệt ñộ phòng và hoà tan lại với 30 µl nước cất không có RNase hoặc nước cất ñã xử lý DEPC. - Sao mã ngược và PCR:
+ Trong buồng vô trùng sạch, chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (master mix) với các thành phần sau ñủ dùng cho số lượng mẫu cần xét nghiệm.
+ Quy trình này ñược áp dụng cho máy nhân gen Cepheid Smart Cycler (Cephied, Sunnyvale, CA).
+ Thông tin về khởi ñộng và cài ñặt chương trình cho máy Smart Cycler có trong quyển hướng dẫn của hãng. Chếñộ chạy RT - PCR cho máy Smart Cycler ñược hướng dẫn trong bảng 2 và 3.
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của bước phiên mã ngược (RT) dùng cho Quiagen one step RT - PCR kit
Bước phiên mã ngược Thời gian (phút) Nhiệt ñộ (0C) 30 50 Một chu kỳ 15 95
Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho tổng hợp gen và các cặp mồi
Cặp mồi Chu kỳ Bước Thời gian
(giây) Nhiệt ñộ (0C) AIV matrix 45 Biến tính 1 94 Bám của cặp mồi 20 60 Biến tính 1 94 H7 40 Bám của cặp mồi 20 58 Biến tính 1 94 Bám của cặp mồi 20 57 H5 40
Kéo dài chuỗi tổng hợp 5 72 (Chú ý: Màu huỳnh quang ñược xác ñịnh ở bước bám gắn của cặp mồi).
Phản ứng RTRT - PCR ñược tiến hành với những thành phần sau cùng với cặp mồi và chu kỳ thích hợp. Khởi ñộng phản ứng với các ống phản ứng ñược
ñặt trong giá ñựng ống lạnh và dùng các ñầu pipet có lọc.
• Các bước tiến hành phản ứng PCR:
Bước 1: Trộn dung dịch Master mix (MM) tùy theo lượng mẫu thí nghiệm. Số
lượng thành phần dung dịch MM trên một mẫu bệnh phẩm là : Rw (nước tinh khiết): 5,5µl.
2X (nguyên liệu): 12,5µl.
PPP (probe, primer xuôi và ngược): 1,5µl. E (enzyme): 0,5µl.
Bước 2: - Trộn 20 µl hỗn hợp MM với 5 µl mẫu thí nghiệm, lắc ñều bằng máy rung Votex.
- Cho 25 µl mẫu ñối chứng vào ống ñối chứng dương. Cho 25 µl nước cất vào ống ñối chứng âm.
Bước 3: ðặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR, bắt ñầu chạy, nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu ñối chứng dương tính, âm tính vào phần cuối ký hiệu mẫu trong bảng kết quả. Lưu chương trình
- Phân tích kết quả xét nghiệm:
+ Giá trị Ct của ñối chứng dương tính ARN ñược sao mã: ðối chứng dương tính ARN ñã sao mã ñược pha loãng ở hàm lượng sử dụng cho giá trị Ct
khoảng 25. Khi ñối chứng dương có Ct cao hơn 29 thì phải làm lại ñể xét nghiệm ñảm bảo. Nếu Ct của ñối chứng dương tính thấp hơn 20, nên pha chuẩn
ñộ lại ñộ pha loãng của ñối chứng. Bất kỳ thời ñiểm nào Ct của ñối chứng dương tính hoặc ñường cong tăng trưởng khác thấp hơn 14, giá trị trừ nền có thể bị sai lệch.
+ Giám ñịnh các mẫu dương tính yếu: Loại bỏ tất cả phản ứng lớn hơn 100 ñơn vị tăng huỳnh quang từ trong ñồ thị (ñiều này làm thay ñổi thước ño ñể
dễ xác ñịnh các trường hợp dương tính yếu. Quan sát riêng từng mẫu sẽ giúp cho phát hiện các phản ứng dương tính yếu.
+ Những mẫu có Ct bằng 35 hoặc lớn hơn ñược xem là dương tính nghi ngờ và ñược xét nghiệm lại.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});